胚胎植入前遗传学诊断-高媛

胚胎植入前遗传学诊断2015.07.18中国济南高媛国家辅助生殖与优生工程技术研究中心山东大学附属生殖医院PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展主要内容PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展主要内容胚胎植入前遗传学诊断-定义胚胎植入前遗传学诊断（PreimplantationGeneticDiagnosis,PGD）是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法。这种方法可有效地防止遗传性疾病患儿的出生，是产前诊断的延伸，是遗传学诊断的又一更有希望的新技术。PGD绒毛采集羊水采集脐血采集胚胎植入前遗传学诊断-背景1.大多数的遗传性疾病目前还缺乏有效的治疗手段。2.对患病胎儿进行选择性流产/引产给孕妇造成身心的双重伤害；3.不可避免遗传性疾病的垂直传递。PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展主要内容胚胎植入前遗传学诊断-发展历史1967年RobertEdwards与RichardGardner完成兔子囊胚活检后的性别鉴定1978年世界第一个试管婴儿在英国诞生（RobertEdwards）1983年KaryMullis提出聚合酶链式反应（PCR）1993年KaryMullis获得诺贝尔化学奖2010年RobertEdwards获诺贝尔生理医学奖1990年英国的AlenHandyside等完成的世界第一个PGD婴儿诞生（X-连锁隐性遗传病）。1992年Handyside等再次完成CFTR的PGD婴儿（常染色体隐性遗传病）诞生，自此PGD得到蓬勃发展。2000年我国中山大学第一附属医院庄广伦教授等完成的国内第一例PGD婴儿诞生（FISH方法完成的血友病PGD）胚胎植入前遗传学诊断-发展历史PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展主要内容胚胎植入前遗传学诊断-适应征非整倍体筛查：胚胎植入前遗传学筛查(PGS)；染色体疾病；单基因病；检测癌症易感基因；HLA分型。胚胎植入前遗传学筛查（PreimplantationGeneticscreening,PGS）是一种所谓的“低风险”PGD,最初是为了提高临床妊娠率和着床率而进行的一种筛查，其适应征为：1.高育龄妇女2.反复胚胎种植失败的夫妇3.复发性流产的夫妇4.不良孕产史等目前，至少有3/4以上的PGD为PGS,它可在染色体水平上高分辨率地检测出非整倍体、片段缺失及重复；被广泛采用的技术包括FISH、ArrayCGH芯片技术等，近年来发展起来的新一代测序技术也开始应用于PGS。G.Hartonetal.,ESHREPGDconsortiumbestpracticeguidelinesfororganizationofaPGDcentreforPGD/PGS.HumanReproduction,2011;26(1):4–24.胚胎植入前遗传学筛查（PGS)NumberofEntriesinOMIM(UpdatedMay19th,2015)OMIM对遗传病及致病基因的统计数据PrefixAutosomalXLinkedYLinkedMitochondrialTotalsGenedescription14,135696483514,914Geneandphenotype,combined8320287Phenotypedescription,molecularbasisknown4,1212924284,445Phenotypedescriptionorlocus,molecularbasisunknown1,525130501,660Other,mainlyphenotypeswithsuspectedmendelianbasis1,713113201,828Totals21,5771,233596522,9341.有遗传病家族史且已明确致病基因位点的常染色体显性、常染色体隐性、性连锁遗传的单基因遗传病夫妇；2.生育的第一个孩子患有恶性疾病如白血病或遗传缺陷，并且在各种医疗措施治疗后无效的，若采用HLA相同的弟妹脐血干细胞移植可以治愈或显著延长生命，可以考虑采用PGD进行HLA相同的后代筛选；3.线粒体相关疾病，若线粒体DNA突变负荷与疾病严重程度成正相关，可以考虑PGD；4.携带有癌症等疾病易感基因的人群单基因遗传病PGD适应征：国际：目前全球已做100，000个PGD临床病例，其中12,000个为单基因遗传病PGD。AnverKulievetal.,AtlasofPreimplantationGeneticdiagnosis,thirdedition,2014国内：常规开展单基因遗传病PGD的生殖中心很少。单基因遗传病PGD的现状:单基因遗传病PGD难点:1.样本难以获取2.痕量样本3.易污染4.等位基因脱扣5.同源重组以上难点是造成单基因病胚胎植入前遗传学诊断发展的主要障碍。PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展主要内容第一代第二代（ICSI)第三代(PGD)精子卵细胞ICSI检测健康胚胎受体的受精卵供体的受精卵（精子为同一来源）受体妈妈的卵细胞供体妈妈的卵细胞体外受精第四代PGD体外受精收集生殖细胞受精卵分裂植入线粒体基因检测试管婴儿与胚胎植入前遗传学诊断18胚胎移植与着床遗传咨询获得家系中所有相关人员的遗传信息基因检测与连锁分析体外受精及胚胎培养卵裂球单细胞活检单细胞的致病靶基因检测及连锁分析12345678910产前诊断健康宝宝出生Start辅助生殖技术治疗胚胎植入前遗传学诊断（PGD)PGD流程PGD/PGS临床流程PGD/PGS的实验室操作流程极体、胚胎活检（极体活检，胚胎卵裂阶段活检，囊胚活检）活检细胞的检测、分析（PCR/FISH/aCGH/SNParray/NGS）胚胎移植或冷冻体外受精、胚胎培养胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的关键技术•如何安全地获得有效胚胎遗传性样本—显微操作取样•如何准确地完成遗传性样本的筛查/诊断—单个/3-5个细胞的检测PGD过程中所涉及的显微操作第1极体移除（1stpolarbodyremoval）3天卵裂球活检（day-3embryobiopsy）5-7天囊胚外胚层细胞活检（day-5–7blastocyst/trophectodermbiopsy）第2极体移除（2ndpolarbodyremoval）卵母细胞胞浆内单精子注射（IntraCytoplasmicSpermInjection,ICSI）第1、第2极体移除（1st&2ndpolarbodyremoval）目前多采用激光打孔、机械切割或Tyrode酸化打孔后吸出细胞的方法取材。PGD过程中所涉及的显微操作优点缺点备注极体1.不影响卵子受精和正常发育；2.不会引起伦理争议；3.对胚胎创伤小，可间接反映母源遗传缺陷1.不能检测父源性遗传缺陷；2.不能检测受精期间或受精后异常；3.极体容易发生退化，影响诊断效率。受精前、后卵裂球1.胚胎数量相对多；2.诊断准确性较高1.检测细胞数量相对少3天后6-10细胞期囊胚1.胚胎完成一次自我选择，临床妊娠率提高；2.可以获得更多的检测细胞数量3.诊断准确性高1.囊胚形成率仅为50%左右，可检胚胎数量有限；2.可供诊断时间短，可能需要冷冻胚胎5-7天囊胚期取滋养层细胞显微操作对胚胎的副作用1.PGD中存在有创过程，可能会对胚胎造成损伤；2.活检过的胚胎，冷冻--复苏的过程可能会使胚胎存活率下降；3.对高龄妇女来讲，卵裂球期活检后胚胎的活产率可能下降。4.对PGD活产儿须有长期随访，以确认其副作用。“两害相权取其轻”的原则1.荧光原位杂交技术（FISH）2.微阵列比较基因组杂交技术（Array-CGH）3.测序技术（Sanger测序、新一代测序NGS）FISHaCGH新一代测序技术Sanger测序技术STR基因分型PGD的各项相关技术荧光原位杂交-（fluorescentinsituhybridization，FISH)FISH问世于20世纪70年代，是在同位素原位杂交基础上发展起来的。原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列，最终完成定性、定位、相对定量分析。Speicher,M.R.etal.NatureReviewsGenetics6,784(2005).微阵列比较基因组学杂交技术-（array-basedcomparativegenomichybridization,aCGH)Sanger测序及STR位点分析新一代测序新一代测序胚胎植入前遗传学筛查（PGS）病例介绍PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展主要内容PGD与伦理非医学需要的选择胚胎性别、智商、容貌等原因引起的选择胚胎，以致带来新一轮“优生”运动按父母意愿选择胚胎-美国案例对迟发性的相关疾病的PGD，要有相应技术检测以排除患病可能。宗教罗马天主教：反对犹太教：认可，但反对基因改造PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展主要内容胚胎植入前遗传学诊断最新发展技术的发展可以提高PGD的准确性SNP芯片或新一代测序技术的应用在检测单基因致病靶基因的同时，可完成染色体水平的检测，减少非整倍体、染色体易位、片段缺失或重复带来的染色体异常；SNP位点检测可对由于交叉重组带来的HLA配型失败进行监控，提高PGD-HLA配型成功率。基因组学的发展依赖于技术的突破人类基因组的序列图“人类基因组工作草图”于2000年6月公布，并分别发表在2001年2月的《Nature》和《Science》杂志约完成全部测序工作的80%编码区仅占基因组的~1-2%，共22,000基因2003年,首次公布准确、完整的基因组序列(2005年，完成约92%)从碱基对到临床实践国家人类基因组研究所（NHGRI）10年规划高通量测序平台的优势灵活样本量样本量1~100个，根据临床需要选择，更加贴近临床需求仪器操作简单仪器操作方便、快捷、数据通量适中，适合医院使用多功能PGD染色体平衡易位携带者检测PGD单基因病单基因病+PGSPGS染色体异倍性检测胚胎嵌合体分析线粒体分析NIPT双胎NIPT检测试管婴儿NIPT检测微缺失/微重复NIPT检测流产组织学分析新生儿遗传病筛查高准确度生物信息学分析软件和完善的技术流程，寻找4Mb微重复/微缺失能够达到99%的准确率。低成本高通量测序技术，分辨率更高、分析速度更快，成本更低短周期出具报告时间快，实验操作部分仅需24小时高通量测序平台的优势高通量测序平台的优势PGD/PGS全基因组/外显子测序基础科研癌症检测NIPT单基因病筛查IlluminaNextseq500LifeiontorrentPGM目前国内比较主流的平台高通量测序平台的临床应用LifeiontorrentProton全外显子组测序在临床实践中的应用•纳入2000例就诊于Baylor医学院并进行全外显子组测序分析的患者•WES为其中25.9%(504/2000)的患者提供了分子诊断(其中31.2%提示神经系统缺陷)•符合孟德尔遗传的疾病模式中53.1%为常染色体显性遗传病，其中(208/280)为新发突变•常染色体隐性遗传疾病占34.3%，104/181—复合杂合SNVs，59/181—纯合变异•X染色体连锁疾病占12.3%，其中新发变异比例是40/65•4.6%患者累及多个基因•平均费