高通量测序样本

高通量测序样本制备葛芹玉[e-mail]高通量测序样本准备的重要性各种不同类型的样本◦基因组DNA（resequencing）◦宏基因组测序（也称微生物环境基因组，或元基因组）◦cDNA◦mRNA◦miRNA◦Methylation◦ChIP-chip◦Exon，Chrom◦etc代表性问题：原始样本的完整性与量的问题、各种偏性、误差、各种可能的污染等等。测序样本制备的基本流程样本核酸的获取（血液，组织，细胞，血清，……）测序文库制备◦DNA文库◦mRNA文库◦miRNA文库◦片段选择文库◦编码文库barcode测序模板制备◦乳液PCR◦桥式PCR◦滚环扩增步骤繁琐……样本核酸准备预处理（片段化，末端补齐，片段筛选等）通用接头连接文库的预扩增（包括反转录等）文库的精确定量测序模板制备（单分子多拷贝）上机测序进一步处理测序模板第一节测序文库制备样本核酸（DNA/cDNA）的质控标准DNA:完整性TotalRNA:完整性（Agilent）miRNAPretreatment某测序公司原始样本需求1.所需TotalRNA的量均不少于20μg/文库，TotalRNA可以保存在DEPC处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。2.如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g；3.如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g；4.如提供实验材料为培养细胞，请提供1×107培养好的细胞；5.如提供实验材料为血液样品，请提供≥2ml的样品。一、样本DNA等的片段化技术1、超声破碎技术能量水平，时间，体积等参数不足之处：体积大易污染精度不够CovarisS-series2010年1月5日报道——安捷伦科技公司(NYSE:A)与Covaris公司于今日宣布了签订一项合作开发市场协议，该协议表明，未来CovarisS2DNA剪切技术将与安捷伦SureSelect靶向序列捕获系统一起销售，以提高新一代测序实验的效率。CovarisAdaptiveFocusedAcoustics™(AFA)浓度不同长度不同物种不同一些比较理想的结果体会：有很大的损失不同的样本需要不同的优化，没有现成可直接用的条件2、片段化酶最初是利用限制性内切酶（Endodeoxyribonuclease）或DNA酶I（DeoxyribonucleaseI）配合Mn2+将DNA大片段切割成小片段针对新一代的高通量测序平台，已经有多家公司开发了配套的酶切试剂，多数是利用几种酶组合而成，其中包含一种可以在双链DNA上有随机识别位点的酶将双链DNA制造切口，然后由另外一种酶将切口处的单链DNA切断形成双链DNA片段Fragmentase：该片段化酶产品包含着两种不同功能的酶，其一可以实现在DNA双链分子上随机制造切口（nick），另一种酶可以识别这种切口并且在互补链对应处制造缺口，从而完全从该处断开双链DNA，从而实现只需根据反应时间的长短获得不同长度的DNA片段，范围为100–800bpDNA。不同的处理反应时间获得的长度有所差异，但是这种处理方法对原始样品的需求较大，而且对于目前主流的二代测序技术而言，还需要进一步切胶选择特定的片段，而且该商品对于不同样品的反应效果均一性有待进一步验证Fragmentase（NEB）GeneratesdsDNAbreaksinatime-dependentmannertoyield100–800bpDNAfragmentsdependingonreactiontime.损失相对较小集中程度不高，需要后续的片段选择3、HydroShearTheHydroshearisusedforfragmentingDNAtosizeslargerthan1KB.TheHydroShearoffersthesimplest,mostreproducible,andmostcontrollablemethodavailableforgeneratingrandomDNAfragments.VirtuallyanysourceofDNAatanyconcentrationinvolumesassmallas40µlcanberandomlyfracturedtowithinatwo-foldsizedistribution.Forinstance,ifyourtargetsizeis2kb,youcancalibratetheHydroSheartoproduceadistributioncenteredon2kbwith90%ofyourDNAfallingbetween1.3kband2.6kbHydroShearHydroShear我们的结果可以实现自动清洗的新设备4、雾化法（Nebulization）DNA雾化仪的工作原理如下：高压氮气从顶端压入，通过两侧的进气道对底部的DNA缓冲液混合物产生压力，液体顺着中部细管上升至顶部。顶部出液口处有筛子之类的东西，DNA通过“筛子”，被打成小片段。通过调节压力大小，可以把DNA打成所需要的bp长度。在使用之前DNA必须经过纯化。雾化法DNA片段化通常采用的DNA溶液体系为：1μg-５μg经纯化的基因组DNA溶解于50μL的TE，并加入700μLnebulizationbuffer。对DNA进行雾化６分钟，气体压力为32--35psi（Poundspersquareinch。P是磅pound，S是平方square，I是英寸inch），雾化环境为冰浴。所得的典型结果为DNA打碎至0–1200bp，峰值为5–600bp雾化法与更早期的酶切法相比，可重复性相对较好，并且对于所处理的DNA序列没有选择性，非常快速并且便宜。但是所得的DNA分子片段长度的区间非常大，使得处于可用区间200±20bp的片段仅占10%左右。为了满足新一代测序的要求，必须要选择长度较为集中的片段，增加的纯化筛选造成了样本DNA的大量流失。这一缺点不仅使成本增加，而且使得痕量DNA的研究难以实现，因而商业推广价值较小。通量较低也是其显著缺点。目前已经基本被CovarisTM超声仪进行超声打碎替代。片段化方法比较数字表达谱二、FragmentRecovery（Sizeselection）1、传统切胶回收◦操作复杂◦专门试剂盒◦效率低◦高效试剂盒开发？2、改进型的凝胶回收(E-gel)7分钟内完成DNA分离（50bp-10kb）选择琼脂糖浓度为0.8%、1.2%或2%且结合有SYBRSafe或溴化乙啶DNA染料的E-Gel无需紫外线即可实时显示DNA迁移，灵敏度超高快捷简单的DNA条带提取适合低、中、高不同通量3、新的仪器设备Caliper的LabchipXT全自动DNA片段回收仪等前期投入大耗材昂贵回收载量低4、新的试剂—bead-basedsizeselection磁珠法纯化试剂：可以进行某特定片段区域的选择E-Z96®Mag-Bind®OligonucleotidePurificationKitAgencourtBioscience◦AMPureBeads◦AMPureXPBeadsNEBnextgenerationseriesAgencourtAMPureXPBeadsSPRIworksFragmentLibrarySystemBeckmanCoulterhascreatedasimplifiedautomatedworkflowthatutilizesSolidPhaseReversibleImmobilization(SPRI)paramagneticbeadbasedtechnologytocreateanautomatedsystemforfragmentlibrarypreparationfortheIlluminaGenomeAnalyzer.三、End-repairT4DNAPolymerase（3’-5’外切）E.coliDNAPolymeraseI(Large(Klenow)Fragment)（5’-3’聚合）T4PolynucleotideKinase（5’磷酸化）四、通用接头连接平末端连接粘性末端连接接头自连接问题？Forkedadaptor（illumina）SinglereadsadaptorPair-endadaptorDNA连接酶的作用机制细菌的DNA连接酶以NAD为能源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP为能源。T4的DNA连接酶可以连接平末端。尼克酰胺单磷酸腺苷基连接酶DNA连接酶RNA连接酶五、各种类型测序文库的构建FragmentPair-endMate-pairDNA/mRNA/miRNAChIP-Seq/MeDIP-Seq/转录组/表达谱等等……PCRAmplification1、FragmentLibrary/single-readLibrary单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，测序引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flowcell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列。2、Paired-endlibraryPaired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-EndModule)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。Mate-pair文库制备旨在生成一些短的DNA片段，这些片段包含基因组中较大跨度(2-10kb)片段两端的序列，更具体地说：首先将基因组DNA随机打断到特定大小（2-10kb范围可选）；然后经末端修复，生物素标记和环化等实验步骤后，再把环化后的DNA分子打断成400-600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠把那些带有生物素标记的片段捕获。这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成mate-pair文库，然后上机测序。3、Mate-pairLibraryMate-pairLibrary（ABI）短序列测序中需要考虑拼接的问题4、编码文库:barcode/Index编码文库的必要性两端编码Indexing(illumina)5、SmallRNAlibrary问题解决办法SOLiDillumina改进的miRNA测序文库制备6、TargetCaptureSequencing/SelectionlibraryMolecularInversionProbe（MIP）靶标富集为了在大样本量中充分发挥新一代测序技术的潜能，科学家们开发出几种方法，来选择性富集目标区域。与全基因组测序相比，富集后再测序降低了成本，也减轻了后续数据分析的压力，让研究人员能够轻松利用新一代测序的通量。目前有几种靶向富集方法，包括分子倒置探针连接测序（MIPS）、基于寡核苷酸杂交三种富集技术：罗氏NimbleGen的SeqCap寡核苷酸杂交型芯片捕获，安捷伦的SureSelect寡核苷酸杂交溶液型捕获以及Raindance的多重PCR方法的方法。三种富集技术比较为了评估这些方法在ABISOLiD3系统上表现如何，来自迈阿密大学米勒医学院以及LifeTechnologies的研究人员评估了三种富集技术。结果发表在plosone上。对于三种方法来说，目标区域都是相同的，大约0.8Mb。富集以及测序之后，利用几个指标来分析SOLiD测序结果，包括各样品间覆盖深度的一致性、击中（on-target）和脱靶（off-target）效率、等位基因偏向以及与芯片数据的基因型一致性。安捷伦的SureSelect表现出优异的击中效率以及各样品间读取深度的一致性。在读取深度为20倍及以下时，NimbleGen的性能很相似。Raindance和NimbleGenSeqCap的读取深度都更严格分布在平