疫苗悬浮培养工艺技术和反应器生产线(武汉)

北京清大天一科技有限公司2010年10月疫苗悬浮培养工艺和反应器生产线主要内容•悬浮培养技术的应用及特点•反应器的分类、结构、功能和选择•悬浮培养工艺（分类、关键技术及选择）•悬浮培养生产线的建立悬浮培养技术概念：细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养液内生长增殖的一种培养方法。全悬浮细胞培养贴壁细胞微载体培养第一部分悬浮培养技术在生物制药中的应用及特点悬浮培养技术在生物制药中的应用历史和现状•早在1962年，BHK21细胞经驯化实现悬浮培养，1965年已实现在不锈钢发酵罐中悬浮培养生产口蹄疫疫苗。•1967年，开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。•20世纪80/90年代，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体的发展极大地推动着生物反应器在生物制药行业中的应用。•全球利用动物细胞表达生产的产品——疫苗、抗体、重组蛋白药物等产品的年销售额占生物制药市场的70％以上。•随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等动物细胞培养技术的发展，生物反应器的细胞培养规模也趋向大型化。–2000年以后，全球生产型动物细胞培养反应器的总规模已超过200万升，几乎都是机械搅拌式反应器；随着细胞培养基技术的发展，不再使用不能放大的反应器。–预计2011年全球生物制药行业的生物反应器使用率将达到85%。•动物细胞培养反应器体积还在不断增大：–生产规模最大达到20000L以上机械搅拌式反应器，如：Amgen（美国）和Lonza（瑞士）：20000L；Genentech（美国）：25000L。国外生物制药生产•人用疫苗：20世纪80年代利用1000L的机械搅拌式反应器培养VERO细胞生产人用狂犬病疫苗和脊灰疫苗（Pasteur，法国）。应用微载体悬浮培养技术生产流感疫苗的机械搅拌式生物反应器规模达到6000L（Baxter，美国）。•动物疫苗：20世纪70年代，开始有2000－5000L的机械搅拌式反应器应用于口蹄疫疫苗生产（Wellcome，英国）。•治疗性抗体：已进入大规模反应器培养动物细胞的生产阶段，生产规模最大达到25000L机械搅拌式反应器（Genentech，美国）。国外悬浮培养应用Baxter公司Vero细胞流感疫苗生产线20000升反应器，Lonza10000升反应器，DSM抗体生产——Lonza、DSM•国内人用和兽用疫苗生产企业超过100家，目前应用反应器悬浮培养技术生产疫苗的仅4家。–超过95%的疫苗企业生产仍然采用批量小、效率低、劳动强度大、占用场地多的转瓶机。–细胞培养基是50年代开发的MEM、DMEM、199、PRMI1640等基础培养基，血清添加比例10％左右，细胞生产效率低。•治疗性抗体研发和生产处于起步阶段，多数采用进口无血清培养基和生物反应器。生物反应器在生物制药中的应用历史和现状——我国生物制药生产•人用疫苗：采用生物反应器生产疫苗的辽宁成大等3家：采用数十台14L-30L量级进口反应器。•兽用疫苗：金宇集团1200L、650L反应器（国产CLAVORUS®）生产口蹄疫疫苗。南京梅里亚（MERIAL）300L引进技术和进口反应器生产法氏囊疫苗。•治疗性抗体：1000升生物反应器生产线（进口）：北京百泰3000升生物反应器生产线（进口）：上海中信国健我国悬浮培养的应用来自金宇保灵网站悬浮培养技术在生物制药中的应用历史和现状——国产动物细胞生物反应器•2008年之前，国产动物细胞反应器规模停留在2～30L，为模仿国外的实验品，未能形成规模化产业。•2008年，国产CLAVORUS®120L、650L机械搅拌式动物细胞培养反应器在疫苗行业中得到成功应用。•2009年，CLAVORUS®1200L反应器上市。清大天一大容量反应器在疫苗生产中的应用，为自主提升我国生物制药产业技术奠定了基础。•未来几年，生物反应器培养动物细胞的方式将逐渐成为我国生物制药产业的主流。CLAVORUS®反应器（位于清大天一工艺实验室）左为CLAVORUS®650L反应器，右为CLAVORUS®120L反应器采用悬浮培养技术生产疫苗的特点•优点–自动化程度高，工艺条件稳定、可控，批量大、均一性好。–无血清或低血清、无动物成分培养，不良反应小。–提高劳动生产效率，减少劳动强度。–减少生产场地需求，提高生产规模。–节能低碳、降低成本。–有利于申报疫苗品种、文号。–存在技术门槛、知识产权，有利于市场竞争。•困难–较高的技术门槛，缺乏支撑技术。–对悬浮培养技术、包括产业化知识了解不足，技术人才缺乏。–基本都是转瓶生产的老厂，需要车间技术改造，一次性资金投入大。GMP车间运行的疫苗悬浮生产线动物细胞培养反应器生产线＋疫苗悬浮生产工艺过程技术1、动物细胞培养反应器生产线－硬件基础2、疫苗悬浮工艺技术（PROCESSDEVELOPMENT）－软件基础动物细胞•细胞和病毒•生物反应器•细胞培养基•细胞培养工艺生物制药核心要素生物制品生产核心要素第二部分核心设备—生物反应器（分类、结构、功能及选择）生物反应器分类-根据反应器的几何特征搅拌式生物反应器:（Stirredtankbioreactor）通过搅拌器的作用使细胞和养分在培养液中均匀分布，如笼式通气搅拌器、双层笼式通气搅拌器、桨式搅拌器等。优点：–用于悬浮细胞与微载体贴壁细胞培养–提供均质环境–培养工艺容易放大–产品质量稳定、非常适合工厂化生产缺点：–搅拌产生的剪切力生物反应器分类—根据反应器的几何特征气升式生物反应器【Airliftbioreactor】：通过气体上升作用带动细胞和养分在培养液中均匀分布，常分为内循环式、外循环式、内外循环式。主要用于一些单抗生产。优点：–均质的培养环境–剪切力小–容易放大缺点：–气体上升对动物细胞的损伤大–泡沫问题严重生物反应器分类—根据反应器的几何特征填充床生物反应器【packedbed】：填充一定材质的填充物，细胞截留在填充物中生长。固定床和流化床等。优点：–高细胞密度和产率缺点：–培养环境不均质–规模较难放大–细胞难以计数一次性反应器：Wave波浪式生物反应器、一次性搅拌生物反应器等。优点：能够高密度培养，使用方便。缺点：放大较难，适宜于实验室规模。工业化成本较高。生物反应器分类—根据反应器的几何特征搅拌式生物反应器是在当前被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产用主流设备。生物反应器应用的发展—国外生物反应器应用的发展—国外辽宁成大广州诺诚金宇保灵生物反应器应用—国内生物反应器的结构(搅拌式）罐体支架管路控制器反应器主要功能（搅拌式）•清洁功能、无菌性（蒸汽灭菌）及密封性•搅拌控制功能•温度控制功能•pH控制功能•溶氧（DO）控制功能•液位控制功能•细胞截留功能………•清洁功能：罐内壁和零部件材质要求，设计无死角•密封性•在线蒸汽灭菌支撑管路（水、电、气）加热系统气体系统蒸汽系统清洁功能、蒸汽灭菌及密封性反应器功能搅拌控制功能搅拌组件分为顶部机械搅拌和底部磁力搅拌，底部磁力搅拌的搅拌叶轮与反应器形成一定夹角，带动料液转动产生涡流，实现料液充分混合。搅拌电机采用无级变速，运行平稳。对细胞培养效果的影响–均匀搅拌以使培养液充分混合，保障营养供给并提高氧传递效果；–由于动物细胞对搅拌剪切力敏感，应充分降低搅拌剪切力；–机械搅拌轴应良好密封，避免污染发生。反应器功能温度控制功能–采用夹套进行温度控制，反应器温度由温度电极进行检测，夹套的加热或冷却，由控制程序自动控制。对细胞培养效果的影响–接种细胞以及更换培养液等过程需要快速升温；–温度稳定性影响细胞生长。夹套蒸汽加热电加热增压泵双温度探头反应器功能pH控制功能–使用pH电极进行检测，由控制程序自动控制酸、碱液的加入，实现pH控制对细胞培养效果的影响–信号响应延时和控制灵敏性影响pH控制稳定性–pH电极和控制器质量影响控制效果，引起控制偏差pH电极pH控制器酸碱蠕动泵反应器功能溶氧控制功能–使用溶氧电极进行检测，由控制程序自动控制各种气体的加入，实现溶氧的控制。对细胞培养效果的影响–信号响应延时和控制灵敏性影响溶氧控制稳定性–溶氧电极和控制器质量影响控制效果，引起控制偏差溶氧电极气体流量计􀂾电磁阀气动隔膜阀􀂾气体过滤器微泡分布器反应器功能液位控制功能–使用反应器进行灌流培养时，为保持培养体积的恒定，需控制反应器培养的液位，可使用液位电极或称重模块来实现。称重控制优势–任意更改培养控制体积，具有更大灵活性。–精确检测及控制培养过程中的物料补充。–并具有底搅拌电机重量保护功能，当液位低于重量保护设定值时，底搅拌电机不被开启。称重模块料液蠕动泵生物反应器的选择满足动物细胞反应器培养的基本前提：–清洁性、无菌性及密封性：无死角，易清洁，达到灭菌彻底、无菌要求及密封性要求，能够满足工业化生产需要。–混合均匀、剪切力小：满足传质、传热需要，同时对动物细胞伤害小。–控制的可靠性、稳定性：疫苗生产工艺对生化参数非常敏感、生产线的稳定性及连续性等。•满足所生产疫苗品种特征、产能的需求–反应器规模、放大配置、生产线数量、场地条件•满足动物细胞培养和病毒培养工艺的具体要求–搅拌浆叶、旋转过滤器等细胞截流装置配件的设计和选择–与所需要培养的细胞工艺相匹配生物反应器的选择生物反应器的选择•标准化、配件提供及售后服务1、工艺接口标准化2、配件提供的速度零部件的维修及更换时的期限；例如使用进口反应器，可能出现维修及零部件更换时间较长等。3、售后服务–售后服务响应时间；–维修配件订货周期；–售后产品装置、调试及操作培训；–产品保修期内的维修；第三部分悬浮培养工艺过程技术悬浮培养技术应用的过程技术目标：提高细胞密度和单位细胞比生产效率，延长高密度细胞的培养周期，从而提高生物反应器的生产效率。过程发展技术：•培养方式的选择：批培养、灌流培养、流加培养•生化环境的优化：温度、pH值、DO溶氧、渗透压、CO2等。•放大技术：全悬浮放大和微载体放大。•基于反应器培养工艺特点的个性化细胞培养基设计和应用：生长培养基、维持培养基、流加培养基……•培养基流加策略：流加速率•代谢控制：减少细胞代谢副产物，提高产量。•细胞贴壁与否？可否驯化？可改造否？–细胞全悬浮培养（CHO、BHK、杂交瘤细胞等）–细胞微载体悬浮培养（VERO、ST、Marc145、MDCK）BHK21细胞ST细胞悬浮培养工艺–批培养–流加（补料）培养–灌流培养批培养流加（补料）培养灌流培养几种悬浮培养工艺（即生物反应器操作方式）批培养优点•操作简单，直观反映细胞在生物反应器中的生长、代谢变化等特点。缺点•但由于初始营养物比较丰富，造成细胞的过量利用，积累大量的代谢废产物，细胞的生长随着受到抑制，生长周期较短，培养基利用率低，细胞密度也不高。特点：具有操作简单、产率高、容易放大等优点。关键：1培养基的优化2流加策略的应用（过程控制）特点：培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，利于保持产品的活性等特点。不足：操作比较繁杂，培养基利用效率低，工艺放大过程困难。流加培养灌注培养主流的悬浮培养生产工艺—发展方向当前被FDA批准的生物技术产品（重组蛋白和抗体为主）和公开发表的主流生产工艺生物反应器：搅拌式生物反应器细胞培养技术：反应器流加培养技术个性化培养基：无血清培养基•选择反应器悬浮培养工艺需要考察的几个因素–细胞和病毒的关系–产物稳定性–培养基或添加物的选择–培养规模•不同的细胞培养和生产工艺不同，采用的培养方式不同–对于分泌型且产品活性降低较快的生物制品，为保持产品的活性，宜采用灌注培养，并且灌注培养更适宜于微载体培养。•同一生物制品由于其营养环境的不同，如无血清培养和有血清培养，其生产工艺也可能发生变化：–BHK21细胞生产口蹄疫，在有血清培养时采用批培养，接毒前需要更换无血清的维持液；而无血清培养整个过程中无需进行换液，但流加培养可能效果更好。提高反应器悬浮培养工艺的生产效率•细胞株和病毒系•过程发展（优化）生化环境流加策略产品回收效率•维持生物制