代谢工程研究及其在柔红霉素产生菌中的应用

··中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2007,38(3)164代谢工程(metabolicengineering)或途径工程(pathwayengineering)，国外也称为细胞工厂(cellfactory)，并归入系统生物学(systemsbiology)中，因为其并非单个基因的改变或重组，而是将整个细胞看成整体，从整体代谢的角度对产物合成进行调控。1991年Bailey[1]在《Science》上发表的文章标志着代谢工程作为一门新兴学科走向成熟。在代谢工程发展的早期，其主要应用包括[2]：①提高细胞代谢产物的量；②产生细胞本身不能合成的新物质；③拓展底物识别范围；④改变细胞的其它生物学特性。随着基因组学(genomics)、蛋白质组学(proteomics)、转录组学(transcriptomics)、代谢组学(metabolomics)等相关学科的兴起，众多专家预测它们将对代谢工程有积极促进作用[3-5]。代谢工程依托组学(omics)研究的平台，在动植物代谢工程及疾病诊断和基因治疗等方面开拓了新的应用领域。代谢工程研究及其在柔红霉素产生菌中的应用胡又佳，朱春宝，朱宝泉(上海医药工业研究院，200040)摘要：综述了应用代谢工程技术对微生物次级代谢的调控，以及与组学研究相结合的研究进展，并结合我院对抗生素产生菌的代谢工程研究，总结了在柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌中所取得的一些阶段性研究结果。关键词：代谢工程；柔红霉素；抗生素；综述中图分类号：Q789；R979.1+4文献标识码：A文章编号：1001-8255(2007)03-0164-06收稿日期：2006-12-01作者简介：胡又佳(1970)，男，2004年在上海医药工业研究院获得博士学位，研究员，从事微生物药物和基因工程的研究。Tel：[phone]×810E-mail：[e-mail]1代谢工程的应用代谢工程的应用最初体现在增加生物关键基因的拷贝数、体内增强关键酶的活性、阻断支路代谢等方面。这在初级代谢产物氨基酸的发酵生产中取得了很好的效果。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和赖氨酸等的发酵水平已有大幅提高[6,7]。代谢工程在对次级代谢产物的调控上也有很大的应用潜力。聚酮化合物是一类重要的次级代谢产物，是由简单脂肪酸经类似长链脂肪酸的合成途径生成的，所得化合物具有复杂多样的结构。催化聚酮化合物生物合成的酶称为聚酮合酶(polyketidesynthase，简称PKS)。通过基因工程方法将编码PKS基因簇的不同模块进行改造、重组或修饰，甚至导入异源的PKS基因，可以产生大量新的聚酮类次级代谢产物。其中以红霉素的生物合成最为典型。红霉素的生物合成基因共分为6个模块，每个模块负责1次二碳单位的延伸以完成红霉素前体6-脱氧红霉内酯B(6-dEB)的合成[8]。除了在红霉素产生菌中进行基因重组外，也有将6-dEB的整套生物合成基因克隆至大肠杆菌中的报道，生物合成所需的酶在大肠杆菌中能高表达并正确折叠，对MetabolicEngineeringandItsApplicationinDaunorubicin-producingStrainHUYou-jia,ZHUChun-bao,ZHUBao-quan(ShanghaiInstituteofPharmaceutical,Shanghai200040)ABSTRACT:Theresearchprogressintheregulationofsecondarymetabolisminmicroorganismviametabolicengineeringanditscombinationwithomicsstudyarereviewedbriefly.Especiallyregardingtoantibioticproduction,extensiveresultsaredescribedindaunorubicin-producingstrainStreptomycescoeruleorubidus.KeyWords:metabolicengineering;daunorubicin;antibiotic;review中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2007,38(3)··1656-dEB的合成表现出正常的生物学活性，产量与红霉素产生菌相近[9]。在抗生素产生菌的代谢工程研究中，头孢菌素C(CPC)也是一个重要产品。对CPC的产生菌顶头孢霉的研究发现，CPC的生物合成中限速步骤有3个酶[10]，分别由生物合成途径中的pcbAB、cefEF和cefG基因编码，分属于生物合成的早、中和晚期步骤。将pcbAB的启动子替换成来自于构巢曲霉的高效启动子gpd，CPC产量有很大提高；而将cefEF和cefG基因的额外拷贝导入顶头孢霉，仅单一拷贝整合入染色体即可检测到更高的转录活性、酶活力，CPC产量也明显增加[11]。此外，若用带小棒链霉菌的cefE代替一株顶头孢霉工业生产菌株中的cefEF基因，重组菌即可高产脱乙酰氧头孢菌素(DAOC)，产量达CPC发酵产量的80％。而DAOC可经二步酶法(D-氨基酸氧化酶和戊二酰转移酶)转化成7-ACA[12]，从而达到高效安全、对环境友好的生产。2与组学研究的结合代谢工程受到组学研究的深刻影响，目前已完成约480个物种的全基因组测序，其中超过3/4的内容已经发表，另有1500多个测序计划正在进行中。这些已测或待测序列中半数以上是微生物基因组的测序，植物、哺乳动物等基因组结果的陆续公布也使传统的代谢工程逐渐向植物、动物及疾病诊断和基因治疗等领域拓展。比如对植物中生物合成途径的调控可以大幅度提高二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等的产量[13]。代谢工程的研究在我国也正蓬勃开展[14]，国家自然科学基金及科技部863等项目中均有代谢工程的内容。据报道已克隆酵母的HMG-CoA还原酶基因牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyldiphosphate，GGDP)合酶基因并构建了融合表达载体，同时构建紫杉烯合酶基因的表达载体，上述两表达载体的共转化已在酵母细胞中建立起合成紫杉醇重要中间体紫杉烯的代谢途径[15]。代谢工程与组学研究的密切结合使我们迎来了极好机遇，但由于代谢调控系统的复杂性，又面临着很大挑战。不但需要利用代谢工程设计全新的代谢途径，并藉此生产具有重大经济价值的生物活性物质，又要与系统生物学等学科相互促进，以更好了解和调控整个细胞的生理生化特性及代谢产物。3我院近年的研究成果近年来，我院也开展了抗生素的代谢工程研究，并取得了一些阶段性研究结果，现概述如下。蒽环类抗生素作为广谱抗肿瘤抗生素，临床主要用于急性淋巴细胞或粒细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤的治疗，对各种实体瘤、脑瘤、血管瘤也有不同程度的缓解作用。其代表品种为柔红霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin)，后者是前者C-14羟化衍生物，相同剂量时后者的疗效更强、不良反应更少、抗肿瘤谱也更广，且无交叉耐药性，上述特性使其具有更高的应用价值[16]。表柔比星为Arcamone等[17]于1975年通过半合成获得，与多柔比星的区别仅在于氨基糖部分4'位的羟基构型不同，但这种立体结构的细微变化即导致其心脏、骨髓毒性明显降低。目前工业生产中多柔比星、表柔比星皆由柔红霉素半合成而来，随着对柔红霉素、多柔比星的生物合成途径不断了解，利用代谢工程来提高柔红霉素的发酵产量仍具重要意义，甚至通过发酵直接生产多柔比星、表柔比星均有可能实现。3.1柔红霉素的生物合成对代谢工程的研究需要对产物的生物合成途径有较清楚的认识。国外不同实验室分别对产柔红霉素的波赛链霉菌(S.peucetiusATCC29050)和链霉菌(S.C5)的生物合成途径进行了研究，结果表明它们的整个生物合成途径是以1份丙酰辅酶A和9份丙二酸单酰辅酶A为合成起点，经多次缩合、还原生成聚酮体链，再经环化、芳香化、甲基化、羟化反应及其它一些修饰反应，并在从1-磷酸-D-葡萄糖出发合成的胸腺嘧啶核苷二磷酸-L-柔红糖胺(TDP-L-daunosamine)参与下，最终生成产物，如图1所示。整个过程可分为3个阶段。第一阶段以丙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A作为链的起始和延伸单位，在dpsA、B、C、D、E、F、G、H、Y等基因编码的酶催化下得到一个含有21个碳原子的聚酮体链中间产物，再经C-9位还··中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2007,38(3)166原、环化和芳香化，得到柔红霉素生物合成途径中第一个稳定的中间体——阿克拉菌酸(aklanonicacid)，再形成阿克拉菌酮(aklaviketone)，然后通过由dnrE基因编码、与NADPH偶联的阿克拉菌酮还原酶将阿克拉菌酮C-7位还原得到阿克拉酮(aklavinone)，最后dnrF基因编码的阿克拉酮羟化酶使阿克拉酮C-11位羟化生成ε-紫红霉酮(ε-rhodomycinone)[18-20]。第二阶段ε-紫红霉酮和TDP-L-柔红糖胺(TDP-L-daunosamine)进行糖苷化反应得到紫红霉素D(rhodomycinD)。催化该反应和形成TDP-L-柔红糖胺的酶由dnm系列基因编码(见图2)。合成起始物1-磷酸D-葡萄糖首先在dnmL编码的胸苷转移酶作用下生成胸苷二磷酸活化的D-葡萄糖，接着在TDP-葡萄糖-4,6-脱水酶作用下生成中间产物TDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖，经C2-脱氧酶及DnmQ和DnmZ协同作用[21,22]，再经转氨、甲基异构及酮基还原，合成产物TDP-L-柔红糖胺。DnmS为糖苷转移酶，负责将第一阶段合成的ε-紫红霉酮与第二阶段合成的柔红糖胺连接在一起，生成紫红霉素D。第三阶段，紫红霉素D在DnrP酯酶的催化作用下经中间产物转化为13-脱氧洋红霉素(13-deoxycarminomycin)，后者在dnrK基因编码的图1柔红霉素和多柔比星的生物合成途径CO2HdpsABCDE12OOHOCO2HCH3OOH12-脱氧阿克拉菌酸阿克拉菌酸(R=H)阿克拉菌酸甲酯(R=CH3)dnrGdnrCdnrDdnrEdnrFε-紫红霉酮阿克拉菌酮阿克拉酮CH2COSCoACH3CH2COSCoA+OOHOCO2RCH3OOHOOOHOCO2CH3CH3OHOOHOHOHOCO2CH3CH3OHOOHOHOHOCO2CH3CH3OHOOHOHFGHYOHOCO2CH3CH3OHOOHOHOdnrPOHOCO2HCH3OHOOHOHOdnrKOHOCH3OHOOHOHO13紫红霉素D13-脱氧洋红霉素dnrP中间产物OH3CNH2OHOH3CNH2OHOH3CNH2OHdoxAOHOCH3CH3OOOHOHOOHdnrUdoxAOHOCH3CH3OOOHOHOO(13S)-13-二氢柔红霉素OHOCH3CH3OOOHOHO13-脱氧柔红霉素OHOCH3OOOHOHOO柔红霉素多柔比星dnrHdnrX鲍霉素类似物CH2OH714OH3CNH2OHOH3CNH2OHOH3CNH2OHOH3CNH2OHTDP-L-柔红糖胺OHOCH3CH3OOOHOHOOHOH3CNH2OHdoxA13-二氢柔红霉素1234568910111213中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2007,38(3)··1674-甲基转移酶的O-甲基化后形成13-脱氧柔红霉素(13-deoxydaunorubicin)。13-脱氧柔红霉素在doxA基因编码的柔红霉素C-14羟化酶的作用下氧化得到柔红霉素[23]。在整个柔红霉素和多柔比星生物合成途径中有3个dnr基因与进一步代谢有关，分别是dnrU、dnrH[24]和dnrX基因。它们编码的酶能将两者进一步代谢为其它产物，但目前其确切功能尚未