植物组织培养中玻璃化问题的研究进展

摘要：综述了组织培养中易出现玻璃化苗的植物种类、玻璃苗的形态解剖特征、生理生化特征、玻璃苗的成因以及防治玻璃苗形成的措施等。易出现玻璃化的植物种达80多种，其中草本植物多于木本植物。玻璃苗的组织含水量明显高于正常苗；糖代谢发生障碍，降解加快，利用滞缓；蛋白质含量及酶活性降低，叶绿素含量显著低于正常苗。取材部位及外植体大小、光照、温度、封口材料、培养基的类型、植物激素等条件不适合都可能引起玻璃化现象。提出了相应预防措施，为克服试管苗玻璃化提供有效的参考。关键词：组织培养；试管苗；玻璃化；生理生化；培养环境长期以来，植物组织培养中存在三大亟待解决的问题——外植体污染、褐化和玻璃化现象，这些因素严重阻碍了植物组培工作的进程。作为三大问题之一的玻璃化现象自从20世纪60年代就受到了关注，Phillips、Hackett等最早描述了石竹茎尖培养时所出现的半透明的异常试管苗现象[1-2]。对玻璃化现象进行系统而又全面的研究是在1981年，Debergh等明确提出了试管植物“玻璃化作用”（vitrification）这一概念。从此，组织培养中玻璃苗的成因和各种防范措施引起了人们的广泛注意。“试管苗玻璃化”是指在进行植物组织培养中，试管苗生长异常，叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状，芽苗矮小肿胀失绿，叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎。这些试管苗在培养过程中发生了一种生理失调或生理病变，表现出分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗。目前，在对许多植物进行微体繁殖的过程中，玻璃苗或多或少都会发生，出现率达到100%。本文在查阅国内外有关试管培养材料玻璃化的形成机理，诱发因素和防治措施等多个方面的基础上，结合自己的研究，提出了相关的看法，以期与同行们商榷。1易出现玻璃化现象的试管苗植物在组织培养过程中，试管苗的玻璃化现象普遍存在，草本与木本植物中均有发生，目前已报道出现玻璃化苗的植物达80多种，草本玻璃化植物多于木本植物。已报道易出现玻璃化苗的木本植物有倒挂金钟、松、樟、瑞香、北美红杉、榕树[10]、琴叶榕、垂柳、美洲绿桤木[10]、陆地棉[11]、月季[11]、珠美海棠、西府海棠[12]、厚荚相思[13]、苹果[14]、红桎木[15]、花楸[16]、红叶石楠[17]、细叶桉[18]、桉树[18]等。草本植物有卷丹、石刁柏、叶子花、彩叶草、紫花苜蓿、菊花、旱芹、彩叶芋、一品红、二色补血草、矮牵牛、香雪球[1O]、金色补血草[10]、马蹄莲[10]、韭葱[10]、芥菜、洋桔梗、天门冬、薄荷、神灯白掌、黄瓜[20]、西瓜[20]、水仙[20]、香石竹、菘蓝[22]、蝴蝶兰[15]、日本粗榧[15]、鸡冠花[23]、大花蕙兰、油菜[24]、花椰菜[24]、重瓣丝石竹、绿巨人、满天星[26]、胡椒[27]、非洲菊[28]、洋蓟等。2玻璃苗的形态解剖学特征玻璃化现象是植物组织培养中特有的一种生理病变，是培养环境中的一些物理、化学因素和生化因子共同作用使植物组织新陈代谢紊乱所致[10,29-30]。玻璃化苗变为矮小肿胀，无节间或节间很短，呈现莲座状，顶梢和叶片部分或全部失绿、为半透明、水浸状，叶片皱缩反卷，芽苗不易分化和生根[31]，Debergh等对洋蓟玻璃苗的形成过程进行了详细阐述：叶片和小叶柄逐渐显示出多水，丛生叶中央的幼叶逐渐肿胀，然后肿胀的小叶突然明显地生长，长度约为正常叶的5～6倍，随后绿色叶片变为半透明，最终坏死。对于组培中形成的玻璃苗解剖结构很早时候就有学者进行了相关研究，其总体解剖学特征是：叶绿体中基质和基粒的组织结构异常，叶绿素含量低，果胶及纤维素等发育不良，叶肉细胞间隙大，表皮组织发育不良，气孔器数量多少不等但功能失常，微管组织联系有缺陷，薄壁组织过度生长，栅栏组织减少或无[32]。陈国菊等在进行荠菜离体培养时，切取玻璃苗和正常苗及茎做常规石蜡切片，用显微镜观察发现玻璃苗细胞增大，栅栏组织和海绵组织不明显，细胞排列疏散、紊乱、间隙大、叶脉粗大突起，茎木质化程度差，导管与管胞很少，维管束不发达，皮层薄壁细胞排列不规则[19]。刘思颖等在观察丝石竹玻璃苗叶片后发现，表皮毛少，气孔开度小，保卫细胞下陷，正常苗的叶片却无此特征[33]。郭东红等发现玻璃苗顶端分生组织原体套结构异常，细胞明显液泡化[11]。这些对玻璃苗形态结构和解剖学特征的研究，不仅使从形态上判定玻璃苗更为便捷与准确，还为从细胞学水平上判定早期未发生形态变化的玻璃苗提供了理论依据。3玻璃苗的生理生化特征3.1组织含水量玻璃化苗体内由于自由水含量及水势增高，束缚水含量降低，导致玻璃苗水分生理异常，生理代谢水平下降，所以玻璃苗的组织含水量明显高于正常苗[12,20]。曹天旭等在称取满天星玻璃苗和正常苗鲜质量后发现组织含水量玻璃苗为95.8%多于正常苗的91.7%[34]。孙庆春等在菊花的玻璃苗研究中也有粪似的发现，菊花玻璃化苗组织含水量明显高于正常苗，差异极显著。3.2组织含糖量糖是植物生长过程中新陈代谢的重要物质，为组培苗的生长提供充足的碳源。周菊花发现香石竹玻璃苗的可溶性糖含量比正常苗增加了38.50%，而蔗糖含量比正常苗下降了63.03%，蔗糖占可溶性糖的比率也比正常苗明显降低，说明玻璃苗的糖代谢发生障碍，降解加快，利用滞缓[21]。孙庆春等发现菊花玻璃化苗的可溶性糖含量极显著高于正常苗，蔗糖含量极显著低于正常苗[31]。玻璃化苗的可溶性糖增加表明植物对糖的利用减少，植物叶片内可溶性糖浓度增加，从而反馈性地抑制光合作用。蔗糖含量低表明玻璃化苗对碳源的吸收和转化能力差。玻璃化苗会因碳源不足，营养物质匮乏，而生长缓慢，增殖率降低。3.3蛋白质含量与正常苗相比，玻璃苗RNA的含量有所降低，但是DNA的含量却保持不变，这表明玻璃苗的异常化过程不是发生在DNA复制过程中，而是发生在转录以后[13]。蛋白质合成受阻，使分化不能正常启动，细胞器的分化发育异常并减少，整个玻璃化过程中光合作用，呼吸作用和蛋白质合成均受影响，使得蛋白质含量及酶活性降低，新陈代谢紊乱[35]。此外，王晨等还发现在福禄考玻璃苗和正常苗的蛋白质差异，既有蛋白质种类的差异，又有蛋白质量的差异，蛋白质的含量不足正常苗的一半[36]。3.4叶绿素含量叶绿素是光能吸收和转化的原初物质，他们都是与蛋白质结合存在于叶绿体的类囊体膜上。叶绿素a可以吸收和转化光能，叶绿素b和类胡萝卜素吸收光能后传给叶绿素a才能进入光系统，完成光能到化学能的转变。曹天旭在研究满天星玻璃苗时发现叶绿素含量玻璃苗明显低于正常苗，其总含量和叶绿素a、b含量仅为正常苗的14%，而叶绿素a、b的比值却无差异，都为0.53[34]。然而，孙庆春在菊花玻璃苗研究时发现菊花玻璃苗叶绿素含量虽然显著低于正常苗，但玻璃苗叶绿素a、b的比值却低于正常苗，分别为2.803、3.463[31]。3.5酶的活性苯丙氨酸解氨酶是控制木质素合成的关键酶，其活性降低会导致木质素的合成受阻[37]。张胜珍等在研究菘蓝玻璃苗时发现苯丙氨酸解氨酶活性与正常苗相比显著降低，这与贾炜龙等的研究结果相一致[22,38]。Frank等发现氧化胁迫的发生及活性氧的积累是导致试管苗玻璃化的重要因子，玻璃苗的SOD活性比正常苗偏高，因此认为SOD偏高引起了H202的积累才是导致玻璃化的主要原因[39]。杨芸等在研究外援H202胁迫对大蒜试管苗玻璃化的影响时提出了相同的观点[40]。客绍英等提出在菘蓝组培苗培养过程中SOD、POD、CAT变化不一致，随着培养时间的延长，正常苗与玻璃苗中SOD活性均呈现上升的趋势；POD活性先降低后迅速升高，而CAT活性则呈现先升高后降低的趋势[22]。对于同一培养时期的试管苗来说，玻璃苗中POD活性高于正常苗，SOD、CAT活性低于正常苗。由于不同植物玻璃苗的过氧化物酶总活性的变化趋势完全不同[41]，因而测定过氧化物酶的总活性也难以确切了解玻璃化发生的原因。3.6内源激素的变化组培苗在发生玻璃化的过程中，内源激素同时也在发生着显著的变化。对于乙烯是否对玻璃苗的形成起作用学术界尚有不同的意见，Kevers和Gaspar报道石竹组培在诱导玻璃化过程中会高速产生乙烯，玻璃苗乙烯产生总是高于正常组织，但乙烯的大量产生可能不会诱发组培苗玻璃化，因为当提高培养容器中乙烯水平和添加乙烯前体ACC时不会诱导玻璃苗的产生[42]。而孙德全等发现过量的乙烯致使叶绿素分解和细胞畸形，破坏了细胞的结构，细胞壁解离，细胞内积累大量纤维素及泡状物质，引起玻璃苗的产生[43]。此外，苹果玻璃苗叶片及茎尖中GA，、IAA、ABA含量显著降低，CTK含量显著上升，但在茎叶极度玻璃化时，CTK含量显著下降[14]。石竹玻璃苗对赤霉素的敏感性也高于正常苗[44]。4玻璃苗成因4.1外植体材料与培养环境4.1.1外植体选择培养植物的种类，取材部位及外植体大小均会显著影响玻璃苗的发生。笔者在大叶相思外植体培养过程中发现，幼叶叶片与顶芽更容易发生玻璃化，当年生枝条在尚未木质化前取材培养，几乎全部玻璃化，外植体材料小于0.5cm时容易发生玻璃化。这可能是外植体的较老组织中含有防止玻璃苗发生的物质，或者是较大外植体的分生组织远离培养基表面，而使其生长环境的水分状况得到改善。4.1.2光照自然光照对玻璃化有抑制作用，玻璃苗放于自然光照下几天后茎叶变红，玻璃化逐渐消失，因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化[37]。戴园园等分别用白光和蓝光对甜瓜试管玻璃苗进行了不同时长的处理，结果表明：不同的光和光强度对玻璃苗的发生都有影响，在蓝光下，玻璃苗发生较为严重，在白光下，玻璃苗发生相对较少，并且随着光照强度的增加玻璃苗发生的几率变小[45]。孙满芝却认为，光照时间太长会导致试管苗玻璃化率显著上升[23]。王爱勤等认为光照条件对芦荟玻璃苗有影响，但影响不大[46]。与此类似的还有郝瑞卿和杨广东的实验，结果显示光照长短与玻璃化率的关系不大，只是在光下诱导出的芽较为绿色健壮。因此对于光照是否对玻璃苗产生影响，影响的程度有多大还没有统一的定论，笔者倾向于光照时长增加会减轻玻璃化程度的观点。4.1.3温度温度是植物生长的主要环境因子之一，适宜组培苗生长的最适温度一般认为在24~260C，适当的低温处理有利于防止玻璃苗的形成，并可以使部分玻璃化后的苗转到正常生长状态，通过变温处理，加大昼夜温差，会使玻璃化现象消失。刘非燕等在重瓣丝石竹玻璃苗研究时发现，随培养温度上升玻璃苗发生率也明显增加，尽管两种不同的培养基培养的试管苗的玻璃化率相差很大，但温度的影响是相似的，当培养温度在17℃时，其中一种培养基完全不发生玻璃苗[47]。Phan和Hegedus对苹果2个品种进行4℃的冷处理，玻璃苗转为了正常苗，但是第2代试管苗又一次玻璃化。4.1.4封口材料常用的封口材料有箔盖、塑料盖、牛皮纸和透气膜等。不同类型的封口材料对培养瓶内的湿度和通气状况有不同的影响，通透性较好的封口材料既能较好地防治细菌和真菌孢子进入培养瓶内，又能达到瓶内外空气交换的目的，克服了玻璃苗的形成。丁国昌在进行厚荚相思试管苗培养时发现，用塑料膜和透气性薄膜都能很好地避免玻璃苗的发生，但采用塑料瓶+透气膜时会更好一些[49]。高疆生等通过定期更换棉塞的方法有效地避免了香石竹试管苗的玻璃化现象，并可将已经玻璃化的苗转为正常苗。李彬在满天星组培中，当封口材料采用棉塞时其玻璃化率比采用聚乙烯塑料膜和锡箔纸时分别降低81.7%和75.3%[26]．4.2培养基的类型4.2.1铵离子浓度研究表明，能够有效避免玻璃苗形成的培养基是MS培养基。增加培养基中的NH4+浓度会加重试管苗的玻璃化现象。李佳莹等在桃的组织培养中采用2MS，结果发现，玻璃化率高达32.42%[so]。花楸幼胚在WPM诱导培养基上玻璃化苗发生率为59.9%，明显高于MS培养基25010的玻璃化率[16]。可见不影响组培苗正常生长的情况下，适当降低铵离子的浓度能够有效防止玻璃化现象。4.2.2蔗糖与琼脂浓度糖在植物组织培养中作为碳源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架，同时可以维持一定的渗透压，与玻璃苗发生率呈显