土壤微生物数量测定方法整理

土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法土壤微生物的分离鉴定及数量测定（一）培养基的制备Ⅰ测定微生物总量培养基：1.细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）牛肉膏Beefextract5.0g蛋白胨Peptone10.0gNaCI5.0g蒸馏水H201000m1琼脂15～20gPH7.2~7.4制备步骤：⑴在100mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解.⑵向小铝锅中加入500mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌.⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000mL.⑷用NaOH或HC1调至pH7.0.用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好.标签表明培养基的名称、配制日期等。⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min.2.放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基）可溶性淀粉20gKNO31gK2HPO40.5gMgSO4•7H2O0.5gNaCl0.5g原0.05gFeSO4•7H2O0.01gpH7.2-7.4制备步骤：（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。（2）称量准确称量各种成分。（3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。（4）分装、包扎、灭菌。植保学院烟草实验室张丽注：各成分按配方顺序依次溶解，对于微量成分，可预先配成高浓度的溶液，方便配置时量的控制。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH。另：倒平板之前，在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液，每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL(l00ppm)。3.真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基）葡萄糖10.0gMgSO4.7H2O0.5g蛋白胨5.0g孟加拉红33.4mg（或者每升加1%溶液3.3mL）K2HPO41g蒸馏水H201000m1PH自然(4-5)制备步骤：（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。（2）称量和熔化按培养基配方，准确称取各成分，并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中待各成分完全溶化后，边加边搅拌,以防糊底,补足水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的溶液，在1000ml培养液中加入1%的孟加拉红溶液3.3ml，混匀后，加入琼脂加热溶化。(3)分装、加塞、包扎、灭菌。(4)链霉素的加入由于链霉素受热易分解，所以临用时将培养基溶化后待温度降低至45摄氏度左右时才能加入。注：⑴灭菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加链霉素。⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培养基加0.lmL。Ⅱ测定功能菌所用培养基：1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A）(NH4)2SO42.0gNaH2PO40.25gMnSO4·4H2O0.01gMgSO4·7H2O0.03gK2HPO40.75gCaCO35.0g蒸馏水1000mlPH7.2注：CaCO3最后加，不需要溶解，直接调PH，培养基中有这个成分是为了缓冲pH。因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，所以要碱性物质平衡酸碱。下同。2.硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基B）NaH2PO40.25gK2HPO40.75gMgSO4·7H2O0.03gMnSO4·4H2O0.01g土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法CaCO31.0gNa2CO31.0gNaNO21.0g蒸馏水1000mlPH7.23.反硝化细菌培养基柠檬酸钠5.0gKNO32.0gKH2PO41.0g,K2HPO41.0gMgSO4·7H2O0.2g蒸馏水1000mlpH值7.2~7.54.好气性自生固氮菌培养基（改良阿须贝(Ashby)无氮培养基）苯甲酸钠1.5gK2HPO40.2gMgSO4·7H2O0.2gNaCl0.2gCaSO4·2H2O0.1gPH7.4—7.6注：在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，要露出液面。5.氨氧化细菌培养基（蛋白胨氨化培养基）K2HPO40.5gKH2PO40.5g,MgSO4·7H2O0.5g蛋白胨5.0g蒸馏水1000mlPH7.0~7.26.好气性纤维素分解菌培养基（依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基）KH2PO41.0gFeCl3·6H2O0.1gMgSO4·7H2O0.3gCaCl2·6H2O0.1gNaCl0.1gNaNO32.5gpH7.2～7．4注：在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，需露出液面。植保学院烟草实验室张丽(二)试剂的配制1.格里斯试剂（GriessReagent）第一、第二液：第一液：将0.5g的对氨基苯磺酸（SulfanilicAcid）溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。第二液：将0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。2.纳氏试剂甲液：将20.0g碘化汞和10.0g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。乙液：将20.0g氢氧化钾溶于100ml水中。分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，放置2天后使用。保存于棕色瓶中。取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。3.二苯胺试剂：溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水中，然后徐徐加入100ml浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。（三）实验器材1.仪器设备4℃冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。2.器材准备⑴将90ml水装入250ml三角瓶中，并装有15-20个玻璃珠，灭菌。⑵将9ml水装入试管，灭菌。⑶试管架，1ml无菌吸管，记号笔，白瓷比色板，接种环，酒精灯等。（四）实验方法1.样品采集在靠近植株根系部,去除表层0-5cm的表土，采集5-20cm土壤剖面,多点采集,混匀后四分法取1kg,装无菌塑料袋带回，4℃冰箱保存。2.悬液制备称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。此为10-1土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。以此类推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的土壤悬液。3.土壤悬液稀释度选择土壤微生物的分离鉴定及数量测定方法⑴细菌:10-4~10-6⑵放线菌：10-3~10-5⑶真菌：10-2~10-4以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。⑷亚硝酸细菌：10-3~10-6⑸硝酸细菌：10-3~10-6⑹反硝化细菌：10-4~10-7⑺好气性自生固氮菌：10-3~10-6⑻氨氧化细菌：10-5~10-8⑼好气性纤维素分解菌：10-2~10-5以上采用最大或然法（MPN），分别设置四个浓度梯度，三次重复。4.接种(平板接种技术)平板接种是用接种环将菌种接至平板培养基上,或用移液管,滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上,然后进行培养.其目的是进行菌落形态观察,分离纯化菌种,活菌计数,或进行其它试验.其方法有多种,根据实验的目的要求不同,可分以下几种.①斜面菌种接至平板划线法:按无菌操作的方法自斜面用接种环直接取少量菌体,在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线,注意不要划破培养基.或先制成菌悬液,接种在平板边缘的一处,将接种环灼烧灭菌,再从有菌的部位如上方法划线接种.点接法:一般用于霉菌菌落观察的接种.无菌操作下,用接种针从斜面或孢子悬液中取少量孢子,轻轻点接在平板培养基上,点接的部位和点接的次数根据实验目的与要求确定.②菌悬液接至平板涂抹法:用灭菌的移液管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板上,然后用无菌的玻璃涂棒将菌液均匀涂布在整个平板上.混菌法:先将菌液加入培养皿中,然后加入融化并冷却至45～50℃的固体培养基,轻轻摇匀,平置,待完全凝固后倒置培养.③平板菌种接至斜面此法一般是将分离培养得到的单菌落,在无菌操作下分别接种到斜面培养基上,以便进一步扩大培养或作保存之用.接种之前先选好平板上的单菌落,并做好标记.左手拿平板,右手拿接种环,在火焰上方或火焰旁边操作,灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却,以免将菌种烫死,然后挑取菌落,在火焰旁边稍等片刻,此时左手将平板放下,拿起斜面培养基,按斜面接种的方法接种.5.培养将所有试管和平板置于25-28℃黑暗条件下避光培养。培养时间由短到长分别为：⑴真菌：2～3d；⑵细菌：3～4d；植保学院烟草实验室张丽⑶放线菌：5～7d。⑷氨氧化细菌：7～8d；⑸好气性自生固氮菌：7～8d；⑹亚硝酸细菌：10～14d；⑺硝酸细菌：10～14d；⑻反硝化细菌：10～14d；⑼好气性纤维素分解菌：10～14d；6.结果观察⑴亚硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（GriessReagent）第一、第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。⑵硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（GriessReagent）第一、第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。⑶反硝化细菌：加入格利斯亚硝酸试剂，观察颜色变化，确定正负反应。⑷好气性自生固氮菌：观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成，或有无圆晕混浊出现。⑸氨氧化细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入纳氏试剂两滴，如有氨氧化细菌存在，则呈棕色或褐色。⑹好气性纤维素分解菌：观察滤纸条是否成团，有无黄色或橘黄色菌斑出现及滤纸断裂情况。7.镜检计数稀释平板菌落计数平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法.⑴混合平板培养法将无菌平板编上10-7,10-8,10-9号码,每一号码设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10-9稀释液各1mL放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各1mL放入编号1×10-8的3个平板中,再吸取1×10-7稀释液各1mL放入编号1×10-7的3个平板中,由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换.然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基(图5-2),轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷凝后倒置,在30℃下培养.至菌落长出后即可计数.⑵涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上,每个编号设三个重复.再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀(图24-3),每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌.在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上20～30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至菌落长出后即可计数.计算结果时,常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克菌