HPLC定量原理及方法

液相色谱实用技术液相色谱实用技术液相色谱实用技术液相色谱实用技术(一一一一)HPLC定量原理及方法液相色谱定量分析的基本原理液相色谱定量分析的基本原理液相色谱定量分析的基本原理液相色谱定量分析的基本原理❀在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物❀液相色谱定量是相对定量的方法:即由已知量的纯被测物标样推算混合物中被测物的量❀液相色谱法定量的依据是:✎被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比✎由已知量的标样可求得定量校正因子✎定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数,其物理意义是单位响应值(峰面积)所代表的被测组分的量✎测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可求得其含量液相色谱定量分析的基本步骤液相色谱定量分析的基本步骤液相色谱定量分析的基本步骤液相色谱定量分析的基本步骤❀开发一个适合定量分析的色谱方法:确认被检测组分峰,并达到分离度(R)大于1.5确定被测组分色谱峰的一致性确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围❀用不同浓度的标准样品建立校正曲线❀考查定量方法的准确度及精密度❀用M32色谱管理系统实施样品采集,数据处理及报告结果鉴别需定量的色谱峰鉴别需定量的色谱峰鉴别需定量的色谱峰鉴别需定量的色谱峰(定性定性定性定性)❀定性鉴别每个要定量的色谱峰✎通过比较保留值(通常是保留时间)的方法,找到各色谱峰所对应的组份✎大多数情况下用与标样比较保留时间来定性❀即所谓：➀保留时间相同，可能可能可能可能是同样的组份➁保留时间不同，肯定肯定肯定肯定不是同样的组份用保留时间定性用保留时间定性用保留时间定性用保留时间定性❀用“标样”的保留值定出被测组份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00AUMinutesUracilEthylparabenPropylparaben进一步的确认进一步的确认进一步的确认进一步的确认(定性定性定性定性)❀标准加入❀同时用其他方法✎其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）✎其他检测器➠PDA，光谱图比较、谱库检索➠MS，质谱图解析、谱库检索✎其他仪器方法标准加入法举例标准加入法举例标准加入法举例标准加入法举例❀废水样品中五氯苯（PCP）的分析梯度曲线梯度曲线PCP4ppm3ppm2ppm1ppm确认定量峰的一致性确认定量峰的一致性确认定量峰的一致性确认定量峰的一致性❀确认色谱峰的纯度✎保证每个色谱峰下只有一个被测的组份✎检查是否有共流出的物质（杂质）干扰❀色谱峰纯度确认的方法✎用光电二极管矩阵(PDA)检测器比较光谱图✎峰纯度鉴定,2487双波长RatioPlot✎996的纯度角理论色谱峰定性中常见问题色谱峰定性中常见问题色谱峰定性中常见问题色谱峰定性中常见问题❀鉴定色谱峰(定性)时常见问题如下:✎被鉴定峰丢失✎色谱图中出峰比预想的少✎色谱图中出峰比预想的多(鬼峰)色谱峰定性中常见问题分析色谱峰定性中常见问题分析色谱峰定性中常见问题分析色谱峰定性中常见问题分析❀被鉴定峰丢失✎保留时间改变✎数据处理系统中输入值不正确❀色谱图中出峰比预想的少✎样品分解✎色谱柱分辨率丧失✎用错流动相✎梯度洗脱时平衡不足(例如,过早将手动进样器扳至(Load)位置色谱峰定性中常见问题分析色谱峰定性中常见问题分析色谱峰定性中常见问题分析色谱峰定性中常见问题分析(续续续续)❀色谱图中出峰比预想的多(鬼峰):✎样品分解或制样时导入了杂质✎流动相被污染,或用错流动相✎流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化✎前次进样的后流出物(某些RT值特大的组分)✎进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏✎未充分平衡进样器Loop管✎保护柱脏,色谱柱被污染,分辨率下降HPLC定量分析的常用术语定量分析的常用术语定量分析的常用术语定量分析的常用术语(1)❀样品(Sample):含有待测物,供色谱分析的溶液❀样品类型(SampleType)分为标样和未知两种:标样标样标样标样(Standard):浓度已知的纯品;未知样未知样未知样未知样(Unknow):浓度待测的混合物❀样品量(SampleWeight):待测样品的原始称样量❀稀释度(Dilution):未知样品的稀释倍数❀组分(Componance):欲做定量分析的色谱峰,即含量未知的被测物❀组分的量(Amount):被测物质的含量(或浓度)HPLC定量分析的常用术语定量分析的常用术语定量分析的常用术语定量分析的常用术语(2)❀积分(Integrity):由计算机对色谱峰进行峰面积测量的计算过程❀定量限:可以准确定量的样品最低量,一般要求色谱峰的S/N＞10:1❀校正曲线(CalibrationCurve):组分含量对响应值的线性曲线,由已知量的标准物建立,用于测定待测物的未知含量常用的定量方法常用的定量方法常用的定量方法常用的定量方法❀标准曲线法,分为外标法和内标法:❀外标法✎在液相色谱中用得最多❀内标法✎准确，但是麻烦✎在标准方法中用得最多外标法定量外标法定量外标法定量外标法定量❀配制一系列已知浓度的标样01234增加溶质的浓度工作标样储存标样外标法定量（二）外标法定量（二）外标法定量（二）外标法定量（二）❀采集不同浓度标样的色谱图❀积分,按外标法定量计算,建立标准曲线05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样样样样样样样样样样样样样样样样响应值峰面积()标准曲线0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes外标法定量（三）外标法定量（三）外标法定量（三）外标法定量（三）❀计算公式❀特点✎无需各组份都被检出、洗脱✎需要标样✎标样及样品测定的条件要一致✎进样体积要准确iXiiiXARFCXRXCRFii样品响应值未知组分的浓度∶标样响应值标样浓度校正因子∶×==)()()()(内标法定量（一）内标法定量（一）内标法定量（一）内标法定量（一）❀配制一系列浓度的标样，其中加有内标样01234增加溶质的浓度工作标样储存标样+储存内标样内标样浓度不变内标法定量（二）内标法定量（二）内标法定量（二）内标法定量（二）❀采集不同浓度标样的色谱图❀积分,按内标法定量计算,建立标准曲线0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.503.003.504.004.505.005.506.00voltsMinutesMethylParabenEthylParabenPropylParabenButylParaben05010015020025001020304050样样样样样样样样样样样样样样样样标样峰面积内标样峰面积标准曲线内标法定量（三）内标法定量（三）内标法定量（三）内标法定量（三）❀计算公式：❀特点：✎无需各组份都被检出、洗脱✎需要标样，需要内标样✎结果与进样体积无关..)()()()().(siiXiiiXAARFCXCXRSIRRFii内标峰面积样品峰面积未知组分的浓度∶标样浓度标样响应值内标样响应值校正因子∶×=×=内标法定量（四）内标法定量（四）内标法定量（四）内标法定量（四）❀对内标物的要求✎化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)✎在样品中不存在✎不与样品中组份发生任何化学反应✎保留值与待测组分接近✎浓度（响应值）与待测组分相当✎其色谱峰与其它色谱峰分离好定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法❀Millennium32包含外标和内标法计算的程序❀处理结果自动存贮至ProjectProject的ResultResult中❀M32定量处理的程序如下:✎调用标样(StandardStandardStandardStandardStandardStandardStandardStandard)的色谱图,在“向导”(WizardWizardWizardWizardWizardWizardWizardWizard)的指引下建立一个处理方法(ProcessingMethodProcessingMethodProcessingMethodProcessingMethodProcessingMethodProcessingMethodProcessingMethodProcessingMethod),将欲定量的峰填入组分表中✎在ProjectProjectProjectProjectProjectProjectProjectProject的的的的ChannalChannalChannalChannalChannalChannalChannalChannal菜单中,选中欲进行定量计算的有关数据文件(按标准standardstandardstandardstandardstandardstandardstandardstandard在前,未知UnknownUnknownUnknownUnknownUnknownUnknownUnknownUnknown在后的顺序),给标样组分表中的各组分填入AmountAmountAmountAmountAmountAmountAmountAmount值并存贮SaveSaveSaveSaveSaveSaveSaveSave之✎按动工具条中的ProcessProcessProcessProcessProcessProcessProcessProcess处理器,则软件自动处理并保存结果定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法(续续续续)打开一个最低浓度的标样打开一个最低浓度的标样打开一个最低浓度的标样打开一个最低浓度的标样((((类型为类型为类型为类型为Standard)Standard)Standard)Standard)色谱图色谱图色谱图色谱图,,,,建立建立建立建立处理方法处理方法处理方法处理方法((((ProcessingMethod)ProcessingMethod)ProcessingMethod)ProcessingMethod)定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法(续续续续)用建立的处理方法计算欲定量的样品用建立的处理方法计算欲定量的样品用建立的处理方法计算欲定量的样品用建立的处理方法计算欲定量的样品定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法定量分析的数据处理方法(续续续续)在在在在Project的的的的Result标签下标签下标签下标签下,,,,观察并报告定量结果观察并报告定量结果观察并报告定量结果观察并报告定量结果液相色谱定量的精密度液相色谱定量的精密度液相色谱定量的精密度液相色谱定量的精密度❀测量的精密度好的精度不好的精度精密度的衡量精密度的衡量精密度的衡量精密度的衡量❀测量精密度的计算)100(X%12)(Xσσ=−
−=
=CVNXiXNiX变异系数∶标准偏差∶平均值∶液相色谱定量的准确度液相色谱定量的准确度液相色谱定量的准确度液相色谱定量的准确度❀误差∶✎E=O-T➠O∶观测到的值➠T∶真值准确度的衡量准确度的衡量准确度的衡量准确度的衡量❀色谱方法是相对定量方法，如不考虑损失及杂质干扰等因素，其结果同“标样”的准确程度密切相关❀一般的衡量方法是做回收率实验或不同方法之间的比较：相关系数❀相关系数：➠其中，X及Y分别代表不同方法的实