抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。（2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。（3）100μMEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。（4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。（5）750uM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。2、酶活性测定（1）取10ml试管（要求透明度好）测试管：分别依次加入3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸（Met）溶液+0.5ml氮蓝四唑（NBT）溶液+0.5mlEDTA-Na2溶液+0.4ml蒸馏水(混合后摇匀)+0.1ml酶液+0.5ml核黄素溶液；对照管（2个）：分别依次加入3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸（Met）溶液+0.5ml氮蓝四唑（NBT）溶液+0.5mlEDTA-Na2溶液+0.5ml蒸馏水(混合后摇匀)+0.5ml核黄素溶液；其中1支试管照光后测定作为最大光还原管，另1支置于暗中测定时用于调零。（2）将一支对照管置于暗处，其余试管置于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；（4）以不照光的对照管调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。SOD总活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4)6.15ml和B母液(NaH2PO4)43.85ml混匀即为100mlPBS；（2）反应混合液配制（以24个样为准）：取75mlPBS(100mM，pH6.0)，加入42ul液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入28.5ul30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。（3）样品测定：空白对照：3ml反应混合液+1ml蒸馏水，作为对照调零；测试管：3ml反应混合液+1ml酶液，立即开启秒表；测定OD470值（测定40秒），每隔30s读一次数。读四分钟,共8次。（4）酶活性计算：以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。2、过氧化氢酶（CAT）活性测定（1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)457.5ml和B母液(NaH2PO4)292.5ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。（2）反应液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（每隔5s读一次数，测定1min）。（4）酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=[ΔA240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml,0.1ml）。五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA：100g三氯乙酸→1L0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸→500ml10%TCA（避光）2、测定步骤:0.2样品+1.6ml10%TCA研磨→12000g离心10min→上清1.5ml+1.50.67%TBA→沸水煮30min→冷却，离心→上清OD450，OD532，OD6003、计算组织中MDA含量：MDA浓度C(umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450MDA含量(umol/gFW)=C×V/W式中V为提取液体积(1.6ml)，W为样品鲜重(0.2g)。六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml大离心管）中，加10ml去离子水，在室温下放置3h使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1)；（3）再放入恒温水浴锅中在100℃沸水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：相对电导率（%）=R1/R2×100%还可以计算植株伤害程度：伤害率=（处理电导率—对照电导率）/（煮沸电导率—对照电导率）×100%