发酵工程

4发酵工程学习目的：①掌握发酵工程的基本原理。②了解典型发酵产品的生产工艺。③认识发酵的基本过程及常用的发酵设备。发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。由于它以培养微生物为主，所以又称微生物工程。发酵(fermentation)昀初来自拉丁语“发泡”(fervere)，是指酵母作用于果汁或发芽谷物产生COl的现象。巴斯德研究了酒精发酵的生理意义，认为发酵是酵母在无氧状态下的呼吸过程。生物化学上将发酵定义为“微生物在无氧时的代谢过程”。目前，人们把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵。发酵技术有着悠久的历史，早在几千年前，人们就开始从事酿酒、制酱、制奶酪等生产。作为现代科学概念的微生物发酵工业，是在20世纪40年代随着抗生素工业的兴起而得到迅速发展的，而现代发酵技术又是在传统发酵技术的基础上，结合了现代的基因工程、细胞工程、分子修饰和改造等新技术。由于微生物发酵工业具有投资少、见效快、污染小、外源目的基因易在微生物菌体中高效表达等特点，日益成为全球经济的重要组成部分。据有关资料统计，在有些发达国家中，发酵工业的产值占国民生产总值的5％。在医药产品中，发酵产品占有特别重要的地位，其产值占医药工业总产值的20％，通过发酵生产的抗生素品种就达200多个。总之，发酵工业在与人们生活密切相关的许多领域中(医药、食品、化工、冶金、资源、能源、健康、环境等)，都有着难以估量的社会和经济效益。4．1发酵工程概况发酵工程的内容是随着科学技术的发展而不断扩大和充实的。现代的发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产，还包括微生物机能的利用。其主要内容包括生产菌种的选育，发酵条件的优化与控制，反应器的设计及产物的分离、提取与精制等。·4．1．1发酵类型目前已知具有生产价值的发酵类型有以下五种：4．1．1．1微生物菌体发酵这是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。比较传统的菌体发酵工业，有用于面包制作的酵母发酵及用于人类食品或动物饲料的微生物菌体蛋白(单细胞蛋白，见8．1．1)发酵两种类型。新的菌体发酵可用来生产一些药用真菌，如香菇类、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共生的密环菌、以及从多孔菌科的茯苓菌获得的名贵中药茯苓和担子菌的灵芝等。这些药用真菌可以通过发酵培养的手段来产生与天然产品具有同等疗效的产物。有的微生物菌体还可用作生物防治剂，如苏云金杆菌、蜡样芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌，其细胞中的伴孢晶体可毒杀鳞翅目、双翅目的害虫；丝状真菌的白僵菌、绿僵菌可防治松毛虫等。所以某些微生物的剂型产品，可制成新型的微生物杀虫剂，并用于农业生产中(见7．1．3)。因此菌体发酵工业还包括微生物杀虫剂的发酵。4。1．1．2微生物酶发酵酶普遍存在于动物、植物和微生物中。昀初，人们都是从动、植物组织中提取酶，但目前工业应用的酶大多来自微生物发酵，因为微生物具有种类多、产酶品种多、生产容易和成本低等特点。微生物酶制剂有广泛的用途，多用于食品工业和轻工业中，如微生物生产的淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖，氨基酰化酶用于拆分D、L—氨基酸等。酶也用于医药生产和医疗检测中，如青霉素酰化酶用来生产半合成青霉素所用的中间体6—氨基青霉烷酸，胆固醇氧化酶用于检查血清中胆固醇的含量，葡萄糖氧化酶用于检查血中葡萄糖的含量等等。4．1．1．3微生物代谢产物发酵微生物代谢产物的种类很多，已知的有37个大类(表4—1)。在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。许多初级代谢产物在经济上具有相当的重要性，分别形成了各种不同的发酵工业。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。次级代谢产物多为低分子量化合物，但其化学结构类型多种多样，据不完全统计多达47类。其中抗生素按其结构类型相似性，可分为14类。由于抗生素不仅具有广泛的抗菌作用，而且还有抗病毒、抗癌和其他生理活性，因而得到了大力发展，已成为发酵工业的重要支柱。4.1.1.4微生物的转化发酵微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、脱羧反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等。昀古老的生物转化，就是利用菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵。生物转化还可用于把异丙醇转化成丙醇；甘油转化成二羟基丙酮；葡萄糖转化成葡萄糖酸，进而转化成2—酮基葡萄糖酸或5—酮基葡萄糖酸；以及将山梨醇转变成L—山梨糖等。此外，微生物转化发酵还包括甾类转化和抗生素的生物转化等等。4．1．1．5生物工程细胞的发酵这是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”以及细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。用基因工程菌生产的有胰岛素、干扰素、青霉素酰化酶等(见9．3．2)，用杂交瘤细胞生产的用于治疗和诊断的各种单克隆抗体等。4．1．2发酵技术的特点微生物种类繁多、繁殖速度快、代谢能力强，容易通过人工诱变获得有益的突变株；微生物酶的种类很多，能催化各种生物化学反应；微生物能够利用有机物、无机物等各种营养源；可以用简易的设备来生产多种多样的产品；不受气候、季节等自然条件的限制等优点。所以源于酒、酱、醋等酿造技术的发酵技术发展非常迅速，并具有以下特点：①发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成；②反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单；③原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源(如植物秸秆、木屑等)，微生物本身能有选择地摄取所需物质；④容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应；⑤发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。4．1．3发酵技术的应用’发酵过程的上述特点体现了发酵工程的种种优点。在目前能源、资源紧张，人口、粮食及污染问题日益严重的情况下，发酵工程作为现代生物技术的重要组成部分之一，得到越来越广泛的应用：①医药工业，用于生产抗生素、维生素等常用药物和人胰岛素、乙肝疫苗、干扰素、透明质酸等新药；②食品工业，用于微生物蛋白、氨基酸、新糖源、饮料、酒类和一些食品添加剂(柠檬酸、乳酸、天然色素等)的生产；③能源工业，通过微生物发酵，可将绿色植物的秸秆、木屑以及工农业生产中的纤维素、半纤维素、木质素等废弃物转化为液体或气体燃料(酒精或沼气)，还可利用微生物采油、产氢以及制成微生物电池；④化学工业，用于生产可降解的生物塑料、化工原料(乙醇、丙酮、丁醇、癸二酸等)和一些生物表面活性剂及生物凝集剂；⑤冶金工业，微生物可用于黄金开采和铜、铀等金属的浸提；⑥农业，用于生物固氮和生产生物杀虫剂及微生物饲料，为农业和畜牧业的增产发挥了巨大作用；⑦环境保护，可用微生物来净化有毒的高分子化合物，降解海上浮油，清除有毒气体和恶臭物质以及处理有机废水、废渣等等。4．2微生物发酵过程微生物发酵过程即微生物反应过程，是指由微生物在生长繁殖过程中所引起的牛化反应的过程。根据微生物的种类不同(好氧、厌氧、兼性厌氧)，微生物发酵过程可以分为好氧性发酵过程和厌氧性发酵过程两大类。(1)好氧性发酵在发酵过程中需要不断地通人一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行的柠檬酸发酵，利用棒状杆菌进行的谷氨酸发酵，利用黄单孢菌进行的多糖发酵等。(2)厌氧性发酵在发酵时不需要供给空气，如乳酸杆菌引起的乳酸发酵，梭状芽孢杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等。此外，酵母菌是兼性厌氧微生物，它在缺氧条件下进行厌氧性发酵积累酒精而在有氧即通气条件下则进行好氧性发酵，大量繁殖菌体细胞，因此称为兼性发酵。根据培养基状态的不同(固体或液体)，微生物发酵可分为固体发酵和液体发酵。如果按照发酵设备来分，又可分为敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵一般敞口发酵应用于繁殖快并进行好氧发酵的类型，其设备要求简单，如酵母生产，由于其菌体迅速而大量繁殖，可抑制其他杂菌生长。相反密闭发酵是在密闭的设备内进行，所以设备要求严格，工艺也较复杂。浅盘发酵(表面培养法)是利用仅装一薄层培养液的浅盘，接人菌种后进行表面培养，在液体上面形成一层菌膜。在缺乏通气设备时，对一些繁殖快的好氧性微生物可利用此法。深层发酵法是指在液体培养基内部(不仅仅在表面)进行的微生物培养过程。液体深层发酵是在青霉素等抗生素的生产中发展起来的技术。同其他发酵方法相比，它具有很多优点：①液体悬浮状态是很多微生物的昀适生长环境；②在液体中，菌体及营养物、产物(包括热量)易于扩散，使发酵可在均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模；③液体输送方便，易于机械化操作；④厂房面积小，生产效率高，易进行自动化控制，产品质量稳定；⑤产品易于提取、精制等。因而液体深层发酵在发酵工业中被广泛应用。4，2．1发酵工业中的常用微生物微生物资源非常丰富，广布于土壤、水和空气中，尤以土壤中为多。有的微生物从自然界中分离出来就能够被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。当前发酵工业所用菌种的总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢控制育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。发酵工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步地成为发酵工业中采用的微生物。4．2．1．1细菌细菌是自然界中分布昀广、数量昀多的一类微生物，属单细胞原核生物，以较典型的二分裂方式繁殖。细菌生长时，单环DNA染色质体被复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横断间隔，染色质体分开，继而间隔分裂形成细胞壁，昀后形成两个相同的子细胞。如果间隔不完全分裂就形成链状细胞。发酵工业生产中常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，主要用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等等。4．2．1．2放线菌放线菌因其菌落呈放射状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较多。大多腐生，少数寄生。放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉没培养之中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，称为菌丝体。菌丝长度既受遗传的控制，又与环境相关。在液体深层培养中由于搅拌器的剪切力作用，常易形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。放线菌的昀大经济价值在于能产生多种抗生素。从微生物中发现的抗生素，有60％以上是放线菌产生的，如链霉素、金霉素、红霉素、庆大霉素等。发酵工业常用的放线菌主要来自以下几个届：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。4．2．1．3酵母菌酵母菌为单细胞真核生物，在自然界中普遍存在，主要分布于含糖质较多的偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶片上，以及果园土壤中。石油酵母较多地分布在油田周围的土壤中。酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。母细胞体积长到一定程度时就开始发芽，芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，昀后形成同样大小的母子细胞。如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝。发酵工业上常用的酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，主要用于酿酒、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶，以及生产可食用、药用和饲料用的酵母菌体蛋白等。4．2．1．4霉菌凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌统称为霉菌。霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性，多腐生，少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，