细菌纤维素-纳米银复合材料的制备及其抗菌性能研究

细菌纤维素/纳米银复合材料的制备及其抗菌性能研究摘要：细菌纤维素（bacterialcellulose,bc）是一种由微生物合成的高纯度纤维素，超细纤维网络结构使其具有高比表面积、高持水能力以及良好的生物相容性和生物可降解性，被认为是一种潜在的“理想”医用敷料材料。然而，细菌纤维素本身不具有抗菌性能，难以应对细菌感染的伤口。纳米银是一种广谱抗菌剂。因此本文以细菌纤维素为模板，采用环境友好的化学还原剂抗坏血酸为还原剂，原位制备细菌纤维素/纳米银复合材料。同时分别采用抑菌圈法和最小抑菌浓度法对复合物的抗菌效果进行评价。关键词：细菌纤维素纳米银抗菌创伤敷料一、引言细菌纤维素是一种由微生物合成的高纯度纤维素，其微纤维直径只有40-60nm，是自然界中天然存在的精细纳米材料。超细纤维网络结构使其具有高比表面积、高持水能力以及良好的生物相容性和生物可降解性，被称作“大自然赋予人类的天然生物医用材料”[1]。大量研究和临床试验表明，细菌纤维素基创伤敷料对于烧伤烫伤以及慢性溃疡疾病具有良好的治愈效果，是一种极具潜力的“理想”创伤敷料材料[2]。然而，细菌纤维素本身不具有抗菌性能，难以应对细菌感染的伤口。金属银及其化合物是目前最常用的无机抗菌剂，尤其适用于治疗烧伤烫伤以及慢性溃疡创伤[3]。因此，以细菌纤维素为载体负载纳米银粒子将有望获得具有高效保湿抗菌功能的“理想”医用创伤敷料。孙东平等以细菌纤维素为载体，甲醛为还原剂采用液相化学还原法合成载银细菌纤维素复合材料，所得银纳米粒子平均粒径在45nm左右，对大肠杆菌、酵母菌和白色念珠菌等都有理想的抗菌效果[4]。marques等分别以细菌纤维素和普通植物纤维为基体，采用nabh4原位还原agno3的方法在纤维素膜上合成纳米银单质，结果表明细菌纤维素纤维的银负载量可达到植物纤维的50倍以上，并且对ag+具有更持久的控释作用，是一种良好的纳米银合成基质[5]。上述研究大多采用nabh4、甲醛等化学试剂为还原剂，这些试剂通常具有较高的人体毒性，反应结束后很难解决试剂在纤维膜内的残留问题，尤其不适合应用于生物医用材料产品的制备。据此，我们提出，以细菌纤维素为模板，摒弃有毒化学还原试剂，采用环境友好的抗坏血酸为还原剂，原位制备细菌纤维素/纳米银复合材料。二、材料与方法（一）实验材料木醋杆菌（acetobacterxylinum）：本实验室保藏。agno3、抗坏血酸购买于国药集团化学试剂有限公司。其它试剂若无特殊说明，均为市场可售。（二）细菌纤维素膜的制备和纯化以木醋杆菌为菌种，将活化后的菌种接种至种子培养液中，在30℃和160rpm的摇床中培养24h。按6%的接种量接种于发酵培养基中，30℃恒温培养箱中静置培养8d，得细菌纤维素膜。培养基组成为麦芽糖25g/l，蛋白胨3g/l，酵母浸膏5g/l，ph值为5.0，121℃灭菌20min。将bc膜取出用去离子水反复冲洗，再浸泡于0.1%的naoh溶液中以去除细菌纤维素膜中的菌体及残留培养基，80℃处理6h至膜呈乳白色半透明。最后用去离子水充分洗涤，直至洗液成中性。（三）细菌纤维素/纳米银复合材料的制备将上述bc膜浸泡于一定浓度的硝酸银溶液中，在30℃恒温水浴锅中100rpm震荡12h。然后将膜取出放入10mm的抗坏血酸溶液中，在磁力搅拌下冰浴还原6h。然后取出用去离子充分洗涤，得细菌纤维素/纳米银复合材料。（四）含银量的测定将制备的复合物样品干燥后剪碎，准确称取一定质量溶解于hno3溶液中。采用原子吸收法测定其银含量。（五）抗菌性能的测定（1）抑菌圈法以金黄色葡萄球菌为模型菌。具体方法为：将金黄色葡萄球菌从斜面接种到种子培养基中，37℃恒温培养12h得种子液。吸取0.1ml种子液至固体平板培养基上，涂布均匀。将载银细菌纤维素膜平铺在平板中央，37℃恒温倒置培养24h。然后测量其抑菌圈大小，并以不载银的纯细菌纤维素膜为对照组。抑菌带宽度定义为：抑菌带半径平均值与样品膜半径平均值之差。（2）最小抑菌浓度法（mic）以金黄色葡萄球菌为模型菌，采用mic法定量评价复合物的抗菌效果。具体方法为：将10个灭菌的含一定量培养基的三角瓶分别编号1-9号，在培养基中放入1-9片载银细菌纤维素膜制成不同含银量培养基。然后，取107cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml接种于上述1-9号三角瓶中，于37℃恒温培养24h。培养结束后，分别从上述三角瓶中取出0.1ml培养液，将其涂布到琼脂平板上，每个样品做三个平行，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，观察菌落的生长情况。以不长菌的最低浓度为最小抑制浓度（mic）。三、结果与讨论（一）细菌纤维素/纳米银复合材料的制备目前化学法还原制备纳米银粒子大多采用nabh4、甲醛等化学试剂为还原剂，这些试剂通常具有较高的人体毒性，反应结束后需解决试剂在纤维膜内的残留问题，不适合应用于生物医用材料产品的制备。抗坏血酸是一种常用的医药原料，具有一定的还原能力。因此本文尝试以抗坏血酸为还原剂，细菌纤维素为模板，原位还原制备纳米银。实验过程中发现，随着反应时间的延长，细菌纤维素膜由初始的透明色逐渐变为亮黄色，表明纳米银粒子在细菌纤维素膜上形成（图1）。（二）含银量的测定分别选用1.0、2.5及5.0mm的硝酸银溶液制备细菌纤维素/纳米银复合材料，采用原子吸收法测定不同硝酸银溶液浓度条件下复合物的载银量情况，结果如图2所示。结果显示，随着硝酸银浓度的升高，复合膜的含银量增加。但当硝酸银浓度大于2.5mm时，继续增加硝酸银浓度，复合物的载银量几乎不变，这说明此时可能达到了细菌纤维素膜的最大银负载量。（三）抗菌活力的评价首先采用抑菌圈法对细菌纤维素/纳米银复合材料的抗菌活力进行定性评价。分别考察了上述三种硝酸银溶液所制备的复合物的抗菌效果（图3）。如图所示，复合物产生的抑菌圈的变化趋势与其载银量相似，这说明复合物载银量的高低与抑菌圈宽度有一定相关性，即载银量越高，抑菌圈越大。采用最小抑菌浓度法定量评价细菌纤维素/纳米银复合材料的抗菌活力，如图4所示。由结果可知，当硝酸银浓度为1.0mm时，mic值最低，说明该制备条件下，复合膜的抗菌效果最好。在较高的硝酸银浓度条件下，由于较高量的银粒子负载到细菌纤维素膜上，可能会产生银粒子团聚，进而影响其抗菌效果。四、结论本文以细菌纤维素为模板，抗坏血酸为还原剂，原位制备细菌纤维素/纳米银复合材料，并对其抗菌活性进行研究。结果表明，在较低的硝酸银浓度条件下，所得复合膜的载银量较低，抑菌圈较小，但其最小抑菌浓度值较低。这可能是由于较低的银负载量减弱了银粒子的团聚现象，导致其抗菌效果较好。基金项目：国家自然基金项目（no.21004008）；上海市教育委员会和上海市教育发展基金会“晨光计划”项目（no.11cg35）。[参考文献][1]czajaw,krystynowicza,bieleckis,brownrm.microbialcellulose—thenaturalpowertohealwounds.biomaterials,2006,27:145-151.[2]alvarezom,patelm,bookerj,markowitzl.effectivenessofabiocellulosewounddressingforthetreatmentofchronicvenouslegulcers:resultsofasinglecenterrandomizedstudyinvolving24patients.wounds,2004,16:224-233.[3]raim,yadava,gadea.silvernanoparticlesasanewgenerationofantimicrobials.biotechnol.adv.,2009,27:76-83.[4]孙东平,杨加志,李骏,周伶俐,于俊伟.载银细菌纤维素抗菌敷料的制备及其抗菌性能的研究.生物医学工程学杂志,2009,26：1034-1038.[5]pintorj,marquespa,netocp,trindadet,dainas,sadoccop.antibacterialactivityofnanocompositesofsilverandbacterialorvegetablecellulosicfibers.actabiomater.,2009,5:2279-2289.出师表两汉：诸葛亮先帝创业未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此诚危急存亡之秋也。然侍卫之臣不懈于内，忠志之士忘身于外者，盖追先帝之殊遇，欲报之于陛下也。诚宜开张圣听，以光先帝遗德，恢弘志士之气，不宜妄自菲薄，引喻失义，以塞忠谏之路也。宫中府中，俱为一体；陟罚臧否，不宜异同。若有作奸犯科及为忠善者，宜付有司论其刑赏，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使内外异法也。侍中、侍郎郭攸之、费祎、董允等，此皆良实，志虑忠纯，是以先帝简拔以遗陛下：愚以为宫中之事，事无大小，悉以咨之，然后施行，必能裨补阙漏，有所广益。将军向宠，性行淑均，晓畅军事，试用于昔日，先帝称之曰“能”，是以众议举宠为督：愚以为营中之事，悉以咨之，必能使行阵和睦，优劣得所。亲贤臣，远小人，此先汉所以兴隆也；亲小人，远贤臣，此后汉所以倾颓也。先帝在时，每与臣论此事，未尝不叹息痛恨于桓、灵也。侍中、尚书、长史、参军，此悉贞良死节之臣，愿陛下亲之、信之，则汉室之隆，可计日而待也。臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顾臣于草庐之中，咨臣以当世之事，由是感激，遂许先帝以驱驰。后值倾覆，受任于败军之际，奉命于危难之间，尔来二十有一年矣。先帝知臣谨慎，故临崩寄臣以大事也。受命以来，夙夜忧叹，恐托付不效，以伤先帝之明；故五月渡泸，深入不毛。今南方已定，兵甲已足，当奖率三军，北定中原，庶竭驽钝，攘除奸凶，兴复汉室，还于旧都。此臣所以报先帝而忠陛下之职分也。至于斟酌损益，进尽忠言，则攸之、祎、允之任也。愿陛下托臣以讨贼兴复之效，不效，则治臣之罪，以告先帝之灵。若无兴德之言，则责攸之、祎、允等之慢，以彰其咎；陛下亦宜自谋，以咨诹善道，察纳雅言，深追先帝遗诏。臣不胜受恩感激。今当远离，临表涕零，不知所言。