凝胶迁移实验(EMSA)实验方法

凝胶迁移实验（EMSA）实验方法凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoreticmobilityshiftassay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。一、实验原理EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。二、实验操作步骤1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。（3）探针制备根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。2、形成蛋白-探针复合物（1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：蛋白样本（2-5μg）Xμlpolyd(I-C)1μlBindingBuffer2μlNuclease-FreeddH2OXμl总体积9μl（2）冰浴5min后，加入1μ探针。（对照组加1ul对照探针）（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。3、制备凝胶，电泳（1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）5XTBE1ml30%Acrylamide/Bis2.2mldeionized,sterilewater6.62ml80%Glycerol80μl10%AP90μlTEMED10μl总体积10ml（2）按标准步骤制备凝胶。（3）加样前先在预冷的0.5XTBEbuffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）4、转膜（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。（2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。5、检测（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）（2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRPconjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）（4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡10min。（5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）（6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。三、实验结果展示（美国SignosisEMSA实验结果）四、Super-ShiftEMSA非纯化的蛋白样本和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，可以加入目的蛋白的抗体，进行超迁移实验，即Super-ShiftEMSA。抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。Super-ShiftEMSA工作原理；在反应体系中，抗体与DNA/蛋白复合物中的蛋白产生反应形成复合物会引起复合物的体积变大，在非变性凝胶中的移动变慢而与DNA/蛋白复合物区别开。进行Super-ShiftEMSA需要考虑以下因素：1）一般先做一般的EMSA测定，成功后才考虑做Super-ShiftEMSA实验。2）不是所有的抗体都可以用于Super-ShiftEMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-ShiftEMSA。3）抗体的浓度要高。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。3）为减少非特异性反应，尽量使用纯化的抗体。4）单抗与多抗都可用于Super-ShiftEMSA，但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。五、常见问题1、为什么看不到迁移带？1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。3）探针与蛋白无特异性的相互作用。4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。5）曝光或者成像时间过短。在Super-ShiftEMSA测定中看不到Super-ShiftDNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-ShiftEMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-ShiftEMSA。7）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。8）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。9）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。2、为什么实验背景高？1）曝光或者成像时间过长。2）封闭时间不足或者效率不高。3）洗涤效果不佳4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。4、Poly(dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用？Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1ugpoly(dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的DNA，其序列与标记探针相同，故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍（w/w）。5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液（12.5mMTris，pH8.3，95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。