人类Y染色体SRY基因的鉴定

山东大学实验报告2013年06月08日姓名班级同组人科目遗传实验题目人类性别决定基因SRY分析学号201100140154第1页共5页山东大学遗传实验报告一、背景介绍SRY基因又称为雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。人的SRY基因位于Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。由于SRY蛋白含有一个典型的DNA结合结构域：高泳动类非组蛋白（highmobilitygroup，HMG）盒基序，类似于已知的转录因子，所以推测SRY编码一个转录因子。SRY的HMG域以一种序列特异的方式与DNA相结合，在双螺旋结构中引入一个尖锐的转折。有证据显示，性反转病人HMG域中的突变可分为两类：影响DNA结合和影响DNA弯曲的，提示这两种性质对于SRY蛋白行使转录调节功能来说都很重要。已发现HMG域在体外能以高亲和力与钙调素（Calmodulin，CaM）相结合。这一现象的功能意义不明，但提示SRY的活性可能受另一个层次的调控。SRY在成年小鼠生殖细胞中表达为一环状转录物，在发育中的小鼠性腺里则转录为一个长4.8kb的RNA，所用的启动子也与成年鼠不同。SRY于大约交配后10.5-11天（dayspostcoitum，dpc）的生殖嵴中专一开启，正好是两性间出现可观察的形态学差异之前；于12.5dpc左右关闭。因此SRY的功能是启动睾丸分化而不是维持睾丸存在。Lovell－Badge认为SRY起一种感受态因子的作用。因为有些小鼠虽然有SRY的表达，但未能把细胞定型到雄性途径。相反在完全没有SRY的情况下，有时卵巢组织也能逆转成睾丸。目前，已经在所有哺乳动物包括有袋目动物中发现了SRY基因。在不同的物种中，SRY蛋白的HMG域高度保守，但是即使是在有亲缘关系的物种之间，SRY蛋白的其余部分也并不同源。还不肯定这是否意味着HMG域是SRY蛋白中唯一功能上重要的区域。Y染色体上95%是男性特异区域，里面含和男性有关的基因，通共有156个转录单位，有78个编码蛋白质的基因,最后是27个完全不同的蛋白。约10%的基因是近几百万年才从X染色体移到Y染色体上来，还有20%是更早以前来自于X染色体，其余是一些回文结构。象中文诗词玩文字游戏一样，DNA的回文也是顺过来和倒过去读都是一样的序列。佩基等发现Y染色体的男性特异区域重复有回文结构，这是以前科学家们没有预计到的。在技术上,重复结构给测序带来很多困难。在科学上，这些重复回文结构的发现对于理解Y染色体有很大帮助。有研究发现：Y染色体有许多重复回文结构的序列，并且这些重复的回文结构有DNA重组能力(具体说叫“基因转换”)，Y染色体自己的一段和另外一段之间进行重组，这样靠自我重组来获得活力。这是第一次知道Y染色体在其男性特异区域有重组，以前这段DNA被称为非重组区域，现在也就改名叫男性特异区域了。这个自我重组能力是进化过程中Y用来自救的重要机制。大规模的基因转换在每一代男孩出现，而且猜想常染色体和X染色体上说不定也有些区域有基因转换，给其它染色体也可能增加“活力”。山东大学实验报告2013年06月08日姓名班级同组人科目遗传实验题目人类性别决定基因SRY分析学号201100140154第2页共5页山东大学遗传实验报告二、实验原理本实验将通过PCR扩增技术，对SRY基因进行扩增，以此验证性别。聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。PCR由变性—退火(复性）—延伸三个基本反应步骤构成。模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。琼脂糖凝胶电泳是利用不同分子量的DNA在琼脂糖凝胶电厂中电泳速度不同而分离DNA片段的方法，琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。在凝胶中，DNA片段（小于20kb）迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。此法以观测，灵敏度较高，而且DNA可以切胶回收，是现在PCR反应后最常用的实验方法，唯一美中不足的是所需要的染剂EB是一种剧毒物质，会引起多种病症的产生，因而在使用中一定需要多加注意。山东大学实验报告2013年06月08日姓名班级同组人科目遗传实验题目人类性别决定基因SRY分析学号201100140154第3页共5页山东大学遗传实验报告三、实验目的1、了解性别决定的SRY分子机制2、掌握口腔上皮细胞和毛囊细胞基因组DNA提取的方法；3、掌握PCR反应的基本原理；4、掌握琼脂糖凝胶电泳法对于条带的鉴定。四、实验材料、试剂及仪器1、实验材料男性的口腔上皮细胞及头发毛囊细胞、女性的口腔上皮细胞及头发毛囊细胞2、实验试剂DNA提取液、0.2mol/LNaOH溶液、0.04mol/LHCl溶液、10XPCR缓冲液、25mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTP、10umol/LSRY引物1、10umol/LSRY引物2、5U/μlTaq酶溶液、无菌水、琼脂糖、缓冲液3、仪器PCR仪、电泳仪、离心机、紫外投影机五、实验步骤1、口腔粘膜上皮细胞或毛发样品DNA的制备（1）男生口腔粘膜上皮细胞或毛发数根，女生口腔粘膜上皮细胞或毛发数根作为对照。（2）剪下带毛囊的发根部分，放入一个200ulPCR管，加20μl的0.2mol/LNaOH溶液，75℃温育30min（在有热盖的PCR仪中反应，以避免水分蒸发）。（3）加入100μl的0.04mol/LHCl中和。（4）12000r/min离心5min去除未溶解的沉淀物，上清转入1个新管，DNA就在水溶液中。2、PCR反应（1）扩增人的SRY基因，所用引物为：SRY1：5’-TGGGACTGGTGACAATTGTC-3'SRY2：5’-GAGTACAGGTGTGCAGCTCT-3'山东大学实验报告2013年06月08日姓名班级同组人科目遗传实验题目人类性别决定基因SRY分析学号201100140154第4页共5页山东大学遗传实验报告（2）每个样品反应体系为25μl。首先将下列成分预混，再分装为4个管：分装到4只0.2mlPCR管中（19μl/管）；其中两管分别加入6μl男生口腔上皮细胞和头发毛囊细胞DNA，另两管加入6μl女生口腔上皮细胞和头发毛囊细胞DNA。反应体系配好后，就可以放入PCR仪中扩增，扩增程序如下：（3）PCR反应条件为：94℃3min94℃30s50℃30s循环35次72℃30s72℃5min10℃∞3、电泳检测制备1%的琼脂糖凝胶，取15μlPCR产物，加3ul的loadingbuffer，混匀，点样，同时点DNA分子量标记，在5V/cm的电压下电泳，电泳结束后用荧光染料溴乙锭(EB)染色，紫外光下观察DNA条带，用凝胶成像系统输出照片；并进行有关的数据分析。试剂名称试剂量PCR缓冲液10.0ulMgCl2（25mM）8.0uldNTP（2.5mM）8.0ulSRT引物1（10uM）4.0ulSRT引物2（10uM）4.0ulTaq酶2.0ul灭菌水40ul山东大学实验报告2013年06月08日姓名班级同组人科目遗传实验题目人类性别决定基因SRY分析学号201100140154第5页共5页山东大学遗传实验报告六、实验结果及分析全班共跑了两块胶，可以看到上方的胶没有跑出来，连marker都没有跑出来第二块儿胶由图可知三号和第七号样品出现条带（经验证，分别为徐霖和吴宏宇，都为男生），一号和五号也为男生但却没有带，可以看到，四号和六号为女生也是没有带的。图中SRY基因大小在300bp左右，与DNAMarker对照可以看见很浅的条带，位于白色圈内。七、思考与讨论1、上方的胶没有跑出带，原因较复杂，可能是由于PCR产物出现的问题，也可能是由于Marker点错了，也有可能是胶的问题2、对于下方的胶中，男生的SRY基因没有跑出来，在与老师交流过程中，我们得到多种可能的原因：（1）加入Taq酶时没有混匀，就进入了PCR仪，导致没有进行有效扩增（2）在提取DNA时，含量太少，导致没有模板，无法进行PCR扩增（3）时间较长，Taq酶在经过各个班级用过之后失活（4）据说冰箱停电过一段时间，很可能导致引物出现裂解，或者酶失活3、化胶的时候一定要让胶完全溶解，否则对于跑胶不利