细胞工程实验-烟草叶片的组织培养

1细胞工程学实验报告专业：_09级生物技术一班__姓名：_____学号：____09121007__2实验一实验室的设计及基本设备一、实验室的设计1、实验室设计的原因：植物细胞工程实验室的流程是：清洗玻璃器皿、配制培养基、高压气灭菌、无菌操作、培养室培养植物、植物材料的检测。因此实验室需要有清洁器皿和配制培养基的准备室，无菌操作室或超净工作台，供培养材料用的培养室，检查培养情况并做记录的实验室。一般在设计上，每个组分最好按工作的自然程序连续排列，如：准备室、灭菌室、无菌操作室、植物材料培养室、检测室。实验室的安排应合理简洁，并要求无尘、灭菌、光洁、清净。2、实验室的布局要求：（1）准备室准备室可以是一大间或几小间，主要用于进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器脿醮涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。必要的设备有:准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。洗涤灭菌区功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿，地面应耐湿并排水良好。设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、超声波清洗器、干燥灭菌器（如烘箱）等。（2）无菌室（接种室）进行植物细胞、组织培养操作的关键是无菌条件。室内的墙壁要求光滑平整；地面为光洁的水磨石，平坦无缝，避免灰尘积累，便于清扫。紫外灯一般在3到4平方米内安装1到2只；在工作台下安置紫外灯紫外灯可使灭菌彻底。同时，工作台上方安装平板玻璃，以防操作时落灰。条件不好时，用无菌箱代替无菌室，箱内用紫外灯灭菌。功能：也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。设备：紫外灯、空调、解剖镜、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针），实验台、搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。（3）培养室功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。要求：约需10-20平方米左右，培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定，其设计以充分利用空间和节省能源为原则。基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等培养室的换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并安装日光灯照明。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。3培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1．7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，日光灯一般用40W，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为2000-3000lx。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%～80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、转床、自动控时器、紫外灯、光照培养箱或人工气候箱、生化培养箱、边台实验台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。5、缓冲间功能：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。要求：缓冲间需3-5平方米，可建在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用1-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。设备：1-2盏紫外灯、水槽、实验台、鞋帽架、柜子、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。二、实验室设备（一）常规设备1、天平组织培养实验室需要2-3台不同精度的天平。感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（电子天平）用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品。感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。2、冰箱各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温报存，某些试验还需植物材料进行低温处理，一般普通冰箱即可。3、酸度计用于测定培养基及其它溶液的pH，一般要求可测定pH范围1-14之间，精度0.01即可。4、离心机用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取。根据分离物质不同配置不同类型的离心机。细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机；核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机；规模化生产次生产物，还需选择大型离心分离系统。5、加热器用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。6、其它纯水器、分装设备（二）灭菌设备维持相对得无菌环境是组织培养实验室的基本要求。1、高压灭菌锅4用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。2、干热消毒柜用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用200℃左右的普通或远红外消毒柜。3、过滤灭菌器用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌，主要有真空抽滤式和注射器式。4、紫外灯方便经济的控制无菌环境的装置，缓冲间、接种室和培养室必备。（三）无菌操作设备1、接种箱是使用较早的最简单的无菌装置，主体为玻璃箱罩、入口有袖罩，内装紫外灯和日光灯，使用时对无菌室要求较高。2、净化工作台其操作台面是半开放区，具方便、操作舒适优点，通过过滤的空气连续不断吹出，大于0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留，保持了较好的无菌环境。由于过滤器吸附微生物，使用一段时间后过滤网易堵塞，因此应定期更换。（四）培养设备培养设备是指根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织和器官培养的设施和设备。1、培养架目前所有植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。成本低、设计灵活、可充分利用培养空间，以操作方便、最大限度利用培养空间为原则。一般有4-5层，层间间隔40-50cm，光照强度可根据培养植物特性来确定，一般每架上配备2-4盏日光灯。2、培养箱细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验，可用光照培养箱、CO2培养箱、湿度控制培养箱等培养。3、摇床进行液体培养时，为改善通气状况，可用振荡培养箱或摇床。4、生物反应器进行植物细胞生产次生产物的实验室，还需生物反应器。（五）其他设备可安装时间程序控制器、温度控制系统或空调；实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备；电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色谱仪、酶联免疫测定系统。四、培养容器与用具培养容器指盛有培养基并提供培养物生长空间的无菌置，培养用具指培养物接种封口所用的各种金属或塑料制品，实验室必备。（一）培养容器包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。玻璃容器，一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。塑料容器材质轻、不易破碎、制作方便，广泛使用。一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器。（二）金属用具1、镊子植物组织解剖用小的尖头镊子，分株转移繁殖转接用枪型镊子，16-22cm长。52、剪刀不锈钢医用弯头剪，做取材和切段转移繁殖，14-22cm。3、解剖刀组织切段，多用短柄可换刀片的医用不锈钢解剖刀。4、其他用具接种铲、接种针在花药培养、花粉培养中有用。（三）塑料用具各种风口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。分数________教师___________时间__________6实验二实验前的准备一、器皿的清洗与包装l．一般玻璃器皿(如锥形瓶、培养皿等)可用毛刷及去污粉或洗衣粉洗去灰尘、油垢、无机盐类等物质，然后用自来水冲洗干净。少数实验要求高的器皿，可先在洗液中浸泡数10min，再用自来水冲洗。最后用蒸馏水洗2～3次。以水在内壁能均匀分布成一薄层而不出现水珠，为油垢除尽的标准。洗刷干净的玻璃仪器160℃烘箱烘干备用。2．使用过的玻璃器皿的洗涤方法试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱烘干。玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2％煤酚皂溶液（来苏尔）或0．25％新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。3．新购置的玻璃器皿含有游离碱，一般先用2%盐酸或洗液浸泡数小时后，再用水冲洗干净。4、金属器皿的清洗不宜用洗涤液清洗，一般用酒精擦拭，并且保持干燥。新用具因其有润滑油及防锈油涂护，用前要用含四氯化碳的布擦去油脂，再用湿布擦，烘干，消毒。5、包装目的是防止消毒灭菌后再次污染，故在消毒处理前经过严格包装。清洗后先晾干再包装起来，才可消毒。包装材料一般用报纸（节省）。二、培养基的配制培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的10、20倍或100倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50mL)或1/200(5mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。Ms培养基的配方：1、大量元素(母液Ⅰ)g／LNH4NO316.50KNO319.00CaCl2·2H2O3.32MgSO4·7H2O3.70KH2PO41.70几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L。72、微量元素(母液Ⅱ)mg/LKI83H3BO3620MnSO4·4H2O1560ZnSO4·7H2O860Na2MoO4·2H2O25CuSO4·5H2O2.5CoCl2·6H2O2.5几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L。3、铁盐(母液Ⅲ)FeSO4·7H2O556mgNa2-EDTA·2H2O746mg溶解后定容至100ml4、肌醇1g溶解定容至100ml5、维生素（100x）烟酸100mg盐酸吡哆醇(维生素B6)100mg盐酸硫胺素(维生素B1)20mg逐一溶解后定容至100ml6、激素的配制2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6—苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.2mg/mL)。其配制