基因工程-克隆载体09

基因工程载体与受体细胞Vectorandhostcell载体的概念载体应具有的特性载体的类型目录目的外源基因分离后，是无法自主进入到宿主细胞并进行复制表达的，必须有一个运载工具将其运达宿主细胞，才能达到复制、扩增和表达的目的载体的概念将外源目的基因带入宿主细胞并能与其一起复制、表达的基因运载工具就叫做基因载体或基因工程载体基因操作的核心工具载体应具有的特性在受体细胞中可以独立地进行自我复制。因此，载体本身必须是一个复制单位即复制子（replicon），具有复制起始点，而且插入外源基因后不会影响载体自身的复制能力。能够带动一定长度的外源基因一起复制易于引入宿主细胞在宿主细胞中具有尽可能多的拷贝数，以利外源基因扩增在质粒非必需区有供外源基因插入的多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）具有一定的容纳外源基因的幅度，即容量具有合适的选择标记载体的分子量要小：降低对转化率的影响；利于容纳较大的外源基因；拷贝高；易于分离；减少了不必要酶切位点在细胞中稳定性高易于从宿主细胞中分离、纯化和鉴定质粒本身必须是安全的最好具有广泛的宿主适应性、核酸序列背景清楚按其来源和本质可分为以下7种：质粒载体(plasmid)噬菌体载体COS质粒（cosmid）。也叫粘粒载体。是质粒与λ的组合噬菌粒载体（phagemid）是质粒与f1的组合病毒载体DNA病毒为主人工染色体载体穿梭载体（shuttle）载体的类型按功能区分：•克隆载体：也叫转移载体，只起转运，扩增作用•表达载体：带有表达功能，即有启动子，可转录和/或翻译•测序载体：只产生单链DNA用于测序，如M13、T载体、U载体•转录及调控载体按照所需宿主细胞的类型分：真核（表达）载体原核（表达）载体穿梭载体质粒载体Plasmid质粒定义：独立于染色体的自主复制的DNA物质。编码非染色体控制的遗传性状特性1、复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点2、拷贝数严紧型（stringentplasmid）:低拷贝松弛型（ralaxedplasmid）：高拷贝质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB1500～700pACYC及其衍生质粒p15A10～212pSC101及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～203．质粒的不相容性（plasmidincompatibility）两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。不相容的质粒一般都利用同一复制系统4、生物学特性（分子标记）质粒可以赋于宿主细胞不同的表型，如抗药性、结合转移特性、产肠毒素或溶血素等质粒表型的表示法：F+/F-、Ampr/Amps、Tetr/Tets、Ampr/Tets、Kanr、Strr、Cmlr、Neor5、质粒的转移和丢失（清除）带有一个tra基因，可以自主地在宿主细胞间通过控制细菌配对和结合而发生转移的质粒叫接合型（conjugative）质粒，又叫自我转移性质粒。无此基因而无此功能者叫非接合型或非自我转移性质粒（no-conjugativeplasmid）非自我转移性质粒：R质粒、Col质粒自我转移性质粒：F质粒及Ent质粒（可产生肠毒素）基因工程中由于使用非接合型质粒，因此质粒的转移需人工条件，一般是用化学（氯化钙）、物理（电击）或其它方法（脂质体）改变细胞膜通透性，使质粒DNA进入细胞，该过程叫转化质粒在自然条件下可从宿主菌中消失，或在人工条件下消失，这叫质粒的消除，俗称丢失。基因工程中质粒，特别是重组质粒的丢失是非常不幸的事可促使质粒丢失的因素：吖啶橙、结晶紫、溴化乙锭、利福平、SDS、紫外线等质粒载体的概念质粒载体是以细菌天然质粒的各种组件为基础，经人工改造、构建而成的特殊质粒外源基因的载体，是基因工程的工具质粒的基本条件1、复制起点：自我增殖，一个或两个（shuttle）2、标记基因选择标记基因：用于鉴别目标DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来筛选标记基因：用于将特殊表型的重组子挑选出来标记基因选择标记氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,Ampr）四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,Tetr）氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat）卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor）蔗糖致死基因SacB：含蔗糖的培养基上sacB基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子筛选标记1.α-互补（α-complementation）α-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，由1024个氨基酸组成）突变体之间实现互补2.插入失活3.GFP筛选标记2.插入失活3.GFP质粒的基本条件3、若干限制酶单一识别位点4、小的分子量、高的拷贝数常用质粒载体克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存DNA片段pBR322系列pUC系列pUC18/19pGEM系列：多功能质粒载体是由pUC质粒改建而来。在多克隆位点两侧多了两个来自不同噬菌体的启动子，即T7和SP6启动子，可用于克隆、表达、转录及测序等。质粒载体的受体细胞基因工程中使用的菌株叫做工程菌，都是经过人工筛选、改造的菌株受体菌的人工改造是接受外源DNA和阳性转化子筛选的基础，改造重点：R—（限制阴性）、M—（修饰阴性）、red—（重组缺陷型，即不能与外DNA发生重组）及抗性，与载体的表型互补（LacZΔM15）（1）DH5α具有α－互补作用，适用于多种质粒载体（2）HB101无α－互补作用（3）JM系列具有α－互补作用噬菌体载体噬菌体载体双链DNA噬菌体载体单链DNA噬菌体载体双链DNA噬菌体载体噬菌体λ是一种双链DNA病毒，大小约48502bp，在噬菌体颗粒中它是以线状形式存在，线状分子的两端有一个12个核苷酸的、5‘-端突起的、可互补的粘性末端（Cohesiveendsite,COS）。当λ侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端连结成环状分子野生型λ噬菌体基因组DNA的MW为48Kb,所以包装上限：105%×48Kb=51Kb必须区段28Kb，所以克隆能力为51-28=23Kbλ噬菌体作为载体的优点：a.可容纳较大的外源DNA片段b.具有较高的感染效率c.由于λ能裂解宿主细胞，容易提取λ载体DNA或重组λDNAd.用λ载体组建的DNA或cDNA文库易于长期保存柯斯质粒载体粘粒载体，由Collins和Hohn于1978年构建Cosmid:cossite-carryplasmid,带有粘性末端位点的质粒。是人工构建的含有λDNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体特点：①具有质粒和λ噬菌体载体的双重特点②可以插入较大的外源基因（31～45kb）柯斯质粒载体质粒复制子、MCS、选择标记cos位点及包装序列（末端酶，能识别两个相距适宜的cos位点），体外包装，高效转染，但不产生子代单链噬菌体载体单链噬菌体包括M13、f1、fd，均为丝状，亲缘关系密切，长度均为6.4kb，单链环状正股DNA分子优点：胞内为双链，胞外为单链。复制型为双链环状DNA，可按细菌质粒使用。单链可用作测序、制备探针、定点诱变。无论双、单链，均不需包装即可感染大肠杆菌，体内包装不受DNA分子大小限制噬菌粒（phagemid,phasmid）质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的载体优点：分子量小（3.0Kb）、克隆能力大（10Kb）、稳定遗传以及用来制备单链或双链DNA（有辅助病毒存在时，载体就以噬菌体的模式增殖，产生单链DNA。若无辅助病毒存在，则以质粒的形式复制，产生双链DNA）等pEMBL(f1与pUC8组成)pBluescript(f1与pBR322组成)。pGEM-TEasy(3kb)，俗称“T载体”（pGEM与f1组成）pUC118/119(M13与pUC18组成)噬菌体的受体菌λ噬菌体的常用宿主菌均为大肠杆菌，但不同性质的载体应选择不同遗传标记的菌株。应查有关资料M13最常用的宿主菌为JM系列（JM101～110）酵母人工染色体(YAC)真正的人工染色体要在寄主细胞中稳定地复制并遗传下去,必须具备三个元件:复制起始区(originofreplication),参与染色体DNA复制起始结构的形成;着丝粒(centromere),负责染色体向子细胞的传递;端粒(telomere),对染色体DNA两个末端起封口和保护作用YAC能容载长达900～1000kb片段。缺点:1)存在嵌合现象(chimerism),即一个YAC克隆中的插入子可能来自两个或多个不同的片段,嵌合体的比例达到10%～50%,这种现象使染色体步行(chromosomewalking)和基因分离难度加大;2)稳定性差,插入片段存在重排和丢失现象;3)插入片段的分离和纯化困难;4)转化效率低。细菌人工染色体(BAC)BAC载体系统是在大肠杆菌F因子的基础上发展而来的,F因子具有稳定遗传的特点,其复制是严紧型的,在每个细胞中仅有1～2个拷贝,减小了插入片段发生重组的机率容载能力一般为100～350kb1)以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建更容易;2)BAC载体以环型超螺旋状态存在,从大肠杆菌中提取较方便3)BAC的复制子来源于F因子,可稳定遗传,嵌合及重组现象少4)克隆位点的两侧具有T7和Sp6聚合酶启动子,可以用于转录获得RNA探针或直接用于插入片段的末端测序优点源于P1的人工染色体(PAC)PAC载体以F因子和噬菌体P1为基础构建,兼有二者的特点,通过电转化可将PAC导入大肠杆菌。特点：PAC载体可以插入约300kb的外源片段,插入的外源DNA没有明显的嵌合和缺失现象,可以稳定遗传及高效扩增。双元细菌人工染色体(binaryBAC,BIBAC)和可转化人工染色体(transformation-competentartificialChromosome,TAC),这些载体不仅具有较大的克隆容量,而且具备了直接转化植物进行功能互补实验的功能。穿梭功能结合BAC载体和Ti质粒的特点表达载体1、基本成分①复制起点②筛选基因③MCS④参与控制转录与转译的遗传元件启动子、转录终止子转译起始序列、转译增强子、转译终止子病毒载体动物病毒载体的特点1、真核表达问题：基因表达2、自主感染、整合：转基因3、基因治疗4、重组疫苗：无毒、多价、多联5、种类繁多，优势突出动物病毒载体的种类1、昆虫病毒载体2、哺乳动物病毒载体昆虫病毒载体多角体病毒（杆状病毒）载体（NPV载体）--转移载体。杆状病毒为环状dsDNA,(30kb),其包涵体称为多角体苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)-秋粘虫家蚕核多角体病毒(BmNPV)-家蚕棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)-棉铃虫baculovirusexpressionvectorsystem,BEVS)Sf9细胞特点属于真核表达体系基因组大，容量大（10kb）安全：不感染脊椎动物，其启动子在哺乳动物细胞中无活性产量高：使用的是晚期启动子，故外源产物对表达系统无影响，多角体蛋白启动子和p10启动子为强启动子可在昆虫细胞培养物和虫体内表达多角体蛋白基因和p10基因为非必需区，可供插入外源基因，重组病毒因插入失活不形成多角体，提供选择标记，且不能形成包涵体，因而不能像野生型病毒那样在外界存活哺乳动物病毒载体应用最多的是双股线状DNA病毒，如痘病毒、疱疹病毒、腺病毒等，另外，还有环状双链DNA的SV40病毒以及反转录病毒SV40病毒环形双链的DNA，分子质量较小；它是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒；包装范围相当严格；寄主细胞的局限性1.晚期区段取代型载体外源DNA取代晚