基因工程4

基因工程GeneticEngineering主讲教师：周国利办公地点：生命科学学院3号实验楼409室。常用号码：06358230050；448953745（网络电话）1Chapter4Enzyme【教学目录与学时分配】章节内容学时分配第1节第2节课程及本章内容简单介绍限制性内切核酸酶其他分子克隆工具酶小结5min145min195min5min2【课程要求】【教学目的】•理解基因工程的工具酶的特点及其应用。【教学重点】•基因工程中所用的重要酶的应用。【教学难点】•工具酶在基因工程设计中的应用。【教学方式】•多媒体讲解结合启发讨论式教学3第一节、限制性内切核酸酶RESTRICTIONENDONUCLEASE4一、寄主限制和修饰系统•Luria,Humann等：T偶数噬菌体；•Bertani,Weigle等：λ和P2噬菌体。•1950年代初期，他们几乎同时发现了限制修饰现象，当时称为宿主专一性。•大量的研究结果证实λ噬菌体所表现的宿主限制和修饰现象更具普遍性和代表性。5(一）E.COLI-λ噬菌体的限制修饰模式67（二）WERNERARBER1969年提出了限制和修饰的概念8宿主一方面通过一种机制限制了噬菌体的活性；另一方面又通过另外一种机制(修饰)改变了噬菌体的DNA分子，使它能够在原来不能生长的宿主细胞中存活.（三）什么是限制和修饰？【★】R/M中的限制作用（restriction)是指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA（外源DNA）导致噬菌体寄主幅度受到限制的现象。•限制酶来完成.9R/M中的修饰作用（modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通过对限制性内切酶酶切位点的甲基化实现的。细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制内切酶识别切割。甲基化酶来完成。10（四）寄主的限制与修饰有两个方面的作用【★】1、保护自身的DNA不受限制2、破坏外源DNA使之迅速降解细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。基因工程中受体菌株常采用缺少限制作用的菌株，以保证基因操作的顺利完成11（五）限制性内切酶系统中有两个部分组成1.核酸酶2.甲基化酶来源：细菌染色体、噬菌体/病毒限制性内切酶不仅受病毒感染的影响，还可随DNA的连接、转导或转染而传给其他个体限制性内切酶是一组可以特异性地识别双链DNA分子中的某一特定核苷序列，并将之DNA磷酸二酯键水解的核酸内切酶。【★】12二、限制性内切酶13限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。（一）I型限制性内切酶来源：首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。如EcoK（第一个分离的内切酶）和EcoB等。同时具有内切酶和甲基化酶的活性，是一个三亚基双功能酶。辅酶：Mg2+、ATP、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）14识别位点：15bp，非常特异酶切位点：识别位点上游约1000bp处15I型限制性内切酶具有极强的ATPase的活性，每打开一个磷酸二脂键就需要消耗1000个分子的ATP。因酶切位点不特异，在基因工程中无意义【★】。16（二）II型限制性内切酶【★】首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个II型限制性内切酶是HindII。是用途最广、最简单的一种限制性内切酶。II型限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如PvuII(157个氨基酸)，也可以比1250个氨基酸的CjeI更大。在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。171.根据II型限制性内切酶作用特点进行的分类根据酶的作用特点，II型限制性内切酶分为3类：（1）最普遍的是HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。有以下4种情况：18a)大部分这类酶都以同源二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；b)但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列；c)一些酶识别连续的序列(如EcoRI识别GAATTC)；d)而另一些识别不连续的序列(如BglI识别GCCNNNNNGGC)。19（2）IIS型酶另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如FokI和AlwI，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。20（3）第三种II型限制性内切酶第三种II型限制性内切酶(有时也被称为IV型限制性内切酶)是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列(如BcgI：CGANNNNNNTGC)，并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。21这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。222.II型限制性内切酶的特点①识别位点与酶切位点高度一致，具有高度特异性。②极为稳定③辅酶：Mg2+233.II型限制性内切酶的命名原则①第1个字母大写，表示来源物种属名的第一个字母。②第2、3个字母小写，表示来源物种种名的前二个字母。③如果细菌有不同的株，则有第四个字母，小写，且与前3个字母紧紧排在一起。HindⅢ：Haemophilusinfluensaed24④若从一种细菌中分离出几种不同的酶，则根据发现顺序用罗马数字表示。SacI(II)：StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)2526限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例：27EEscherichia（属）cocoli（种）RRY13（品系）I首先发现在此类细菌中发现的顺序几种限制性内切酶命名原则举例细菌原名细菌种名菌株名称限制酶名称ArthrobacterLuteusAluⅠBacillusamyloliquefaciensHBamHⅠEscherichiaColiRY13EcoRⅠHaemophilusinflueuzaeRdHindⅢ284.II型限制性内切酶的识别顺序【★】①II型限制性内切酶的识别序列非常简单，由４-8个相连的核苷酸29②识别序列一般是回文序列30③简并识别序列有些酶的识别序列不是一个，而是多个。在基因重组时要尽量少用这些酶315.II型限制性内切酶的酶切位点【★】II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或附近，产生以下4种情况。①5’粘性末端；②3’粘性末端；③平末端④非互补的粘性末端32无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内切酶，所留下的残端都是一样的。经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是保留一个OH3334①5’粘性末端(STAGGEREDENDS)35②3’粘性末端(STAGGEREDENDS)36③平末端（BLUNTEND）37④非互补的粘性末端38粘性末端的意义①连接便利•a)不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平末端要容易的多。•b)同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。39②5’末端标记a)凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。b)凸出的3’末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③补平成平末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平末端。406.II型限制性内切酶的同裂酶和同尾酶【★】来源不同的II型限制性内切酶，具有相同的识别序列时，称为同裂酶(Isoschizomer)。有2种情况：①酶切以后的残端完全相同：②酶切以后的残端不同：41来源不同，识别序列也各不相同，但酶切以后的残端相同，这种情况称为同尾酶(Isocandamers).42由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接。在基因克隆中很有用！同尾酶的粘性末端互相结合后开成的新位点一般不能在被原来的酶识别,WHY？437.II型限制性内切酶的酶切位点在DNA上出现的频率II型限制性内切酶的酶切位点在DNA上出现的频率受DNA的长度、识别位点的长度以及GC含量的影响。4bp的识别位点：1/44＝256bp如：HaeIIIGGCC6bp的识别位点：1/46＝4096bp如EcoRIGAATTC448.DNA甲基化对II型限制性内切酶的活性的影响大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：45①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。469.II限制性内切酶不具有甲基化功能4710、II限制性内切酶对单链DNA的活性对单链DNA没有作用，但局部有双链结构时可以特异性地切断。DNA和RNA的杂交产物也是双链结构。可以切断。4811.II限制性内切酶对寡核苷酸的活性49尽管是双链、有识别位点，但因为太短，酶不能与DNA有效结合，所以不能切割。当2个酶切位点距离非常近的时候，它们之间由于竞争结合位点，所以也会相互干扰。12、II限制性内切酶的最佳反应温度与酶的来源有关。反应温度可以影响酶的活性，但不影响特异性。①一般为37℃；②TaqI、TstI和TstII的反应温度为65℃；③XbaI为30℃。限制酶酶切反应的终止：大多数酶可用65℃温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。5013.II限制性内切酶的完全与不完全消化51可以通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶用量来实现、增大反应体积。完全消化52不完全消化53思考题？我只想到三种原因(M,M,UND)545514.酶的活性单位一个单位的限制性内切酶相当于在标准条件下，1小时内消化1μg的λ-DNA所需的酶的量。5615.影响RE活性的因素【★】5758596016.星号活性(STARACTIVITY)【★】某些Ⅱ限制性核酸内切酶对反应条件的要求比较苛刻，当反应条件发生变化后，酶的特异性发生相应的改变称为星号活性。如EcoRI的反应条件为pH7.3，100mMNaCl，5mMMgCl2，识别序列为GAATTC;当改变了pH，降低了Na+，或用Mn2+代替Mg2+，则识别位点就变为AATT。6162星号活性产生的原因如下①反应体系中甘油的浓度大于5%。②酶用量过大，大于100U/μgDNA。③低离子强度，小于25mmol/L。④高pH，大于8.0。⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二