基因工程与克隆技术

学案基因工程与克隆技术核心术语——(记准、写准、理解透，把握内涵和外延)1.基因工程（限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体、目的基因、基因表达载体、农杆菌转化法、显微注射法、感受态细胞）2.蛋白质工程（预期功能、分子设计、DNA合成）3.植物细胞工程［植物组织培养（脱分化、再分化、愈伤组织、丛芽）、植物体细胞杂交（原生体融合、杂种细胞、杂种植株）］4.动物细胞工程［动物细胞培养（原代培养、传代培养、细胞株、细胞系）、动物细胞核移植、动物细胞融合（杂种细胞、单克隆抗体）］基因工程相关知识整合概述基因工程和蛋白质工程基本操作过程，并思考下列问题。答案基因工程基本操作过程：获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。蛋白质工程基本操作过程：蛋白质预期功能→蛋白质的三维结构氨基酸序列的多肽链基因（DNA）分子设计DNA合成（1）基因工程诞生的理论基础和技术支持分别是什么？答案①理论基础：DNA是遗传物质；DNA双螺旋结构和中心法则的确立；遗传密码的破译。②技术支持：基因转移载体的发现；工具酶的发明；DNA体外重组的实现；重组DNA表达实验的成功。（2）基因工程的基本操作步骤中哪几处用到了限制酶，其特性和来源是什么？又有哪几处涉及碱基互补配对？答案限制酶在第1、2步中用到而且要求同一种，目的是产生相同的黏性末端；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，它能识别DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键，产生的末端有黏性末端和平末端；只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。（3）基因表达载体如何构建？答案（4）将目的基因导入受体细胞的常用方法？答案植物细胞：农杆菌转化法；动物细胞：显微注射法；微生物：Ca2+处理法。（5）目的基因的导入与表达如何进行检测与鉴定？答案①分子水平检测a.导入检测：DNA分子杂交技术，即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作探针检测。b.表达检测②个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。转录检测：分子杂交法，即目的基因作探针与mRNA杂交翻译检测：抗原—抗体杂交法（09·沈阳质检）转基因植物油是由转基因植物通过压榨或浸出法加工制得的，因其出油率高而被广泛采用。我国是植物油消费大国，每年都从国外进口大量的转基因植物油。（1）在培育转基因油料植物的过程中，基因操作需要的工具酶是。在基因表达载体中，目的基因的首端必须含有，它是识别和结合位点。（2）请写出一种将目的基因导入油料植物细胞可以采用的方法：。若受体细胞为植物体细胞，可采用技术获得转基因植物体，该技术所依据的原理是。限制性核酸内切酶和DNA连接酶启动子RNA聚合酶农杆菌转化（或基因枪、花粉管通道）法植物组织培养植物细胞全能性（3）若要检测（2）中获得的植物细胞染色体上是否含有目的基因，可采用技术。而想要得知上述植物是否真的出油率高，应如何做？。（4）若利用蛋白质工程继续提高油料植物的出油率，其设计流程应从预期的出发，设计预期的结构，推测出应有的序列，然后找到相对应的序列，再用转基因技术改变其现有性状。DNA分子杂交将该植物制出植物油与同等质量的非转基因植物制出的植物油称重比较蛋白质功能蛋白质氨基酸脱氧核苷酸关键信息“工具酶”、“植物细胞”、“原理”、“染色体上”、“预期”知识依据基因工程和蛋白质工程完整分析（1）转基因植物的培育过程中，基因工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，目的基因只有含有启动子，才能被RNA聚合酶识别并与之结合进行转录。（2）接受目的基因的受体细胞若为植物体细胞，可采用植物组织培养技术获得转基因植物。（3）通过对比转基因植物与普通的非转基因植物的出油率，可得知转基因植物是否真的出油率高。（4）蛋白质工程设计流程是：预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推出应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列。植物组织培养和植物体细胞杂交图示植物组织培养和植物体细胞杂交过程，并思考下列问题。（1）上述两过程依据的原理是什么？答案植物组织培养：细胞全能性；植物体细胞杂交：细胞膜的流动性和细胞的全能性。（2）在植物体细胞杂交过程中，原生质体经诱导剂处理后，会有几种细胞类型？答案5种：甲、乙、甲甲、乙乙、甲乙野生马铃薯品种的植株具有较强的抗病、抗虫、抗盐碱、抗寒能力，但块茎不能食用。俄、德、芬兰专家共同做实验研究，用野生马铃薯与马铃薯的体细胞进行杂交，培育出了生活能力强的杂交系马铃薯。据图分析回答问题：（1）①过程植物细胞原生质体的分离需经过酶解，其中“酶解”所用的酶应该包括。（2）②过程可用聚乙二醇（PEG），其目的是。（3）请用文字和箭头表示出④⑤技术过程的实验流程：。由此过程可以看出植物细胞有形成完整个体的可能性，这是。（4）在培养基上培养一段时间后，原生质体会再生出细胞壁。可以取样，通过实验来鉴别细胞壁是否已经再生。纤维素酶、果胶酶诱导原生质体融合融合细胞愈伤组织幼苗脱分化再分化植物细胞具有全能性的表现植物细胞的质壁分离与复原（5）请说明运用植物体细胞杂交法的最大好处：。可以克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍关键信息“酶”、“聚乙二醇”、“文字和箭头”、“细胞壁”知识依据植物体细胞杂交完整分析（1）若去掉细胞壁而获得原生质体，需用纤维素酶和果胶酶来处理。（2）用聚乙二醇处理原生质体，可以诱导原生质体融合。（3）④⑤分别为脱分化和再分化过程，能够形成一个完整植株，体现出植物细胞的全能性。（4）可以通过质壁分离与复原实验来鉴别原生质体是否再生出细胞壁。（5）植物体细胞杂交最大好处在于可以克服远缘杂交不亲和的障碍。图示动物细胞培养、细胞核移植和单克隆抗体制备过程，并思考以下问题。动物组织工程技术的相关知识整合（1）上述过程的原理是什么？答案①动物细胞培养：细胞增殖；②细胞核移植:细胞核全能性；③单克隆抗体的制备原理：a.免疫原理：经免疫的B淋巴细胞产生特异性抗体。b.增殖原理：骨髓瘤细胞能在体外培养的条件下大量增殖。c.融合原理：细胞膜的流动性以及病毒对宿主细胞的穿透性。（2）区分原代培养和传代培养、细胞株和细胞系。答案原代培养：可有两种表述。a.细胞悬浮液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养；b.第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。两种表述没有本质区别。传代培养：同样有两种表述。a.细胞悬浮液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养；b.传10代以后的细胞培养，统称为传代培养。细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右会出现生长停滞，衰老死亡，少数度过“危机”的细胞能传40~50代，形成细胞株。细胞株的遗传物质并没有发生改变。细胞系：细胞株传至50代以后，会出现第二次危机，少数度过第二次危机的细胞能够无限制地传下去，形成细胞系。细胞系的遗传物质发生了改变，有癌细胞的特点。（3）单克隆抗体制备过程中有哪两次筛选？答案第一次筛选是将未融合的B细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。第二次筛选是将产生特定抗体的杂交瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内获取的免疫过的B淋巴细胞有很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。（09·潍坊质检）人CD20单克隆抗体是治疗一些恶性肿瘤的特效药物，目前主要是通过培养哺乳动物细胞的方式生产。我国科学家已经培育出世界上第一头转入了CD20抗体基因的转基因牛，可以从它产的牛奶中直接提取CD20抗体。这项技术成熟后，有望使这一特效药的生产成本降至现在的1/10。请回答：（1）单克隆抗体的制备过程需先将融合，这一过程的诱导方法与植物体细胞杂交不同的是。（2）动物细胞培养需要在含混合气体的培养箱中进行，培养液中通常需加入等一些天然成分。经过免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞用灭活病毒诱导血清、血浆95%空气加5%CO2（3）转基因技术的核心是。该过程用到的工具酶有和。基因表达载体的构建限制性核酸内切酶（限制酶）DNA连接酶关键信息“单克隆抗体”、“植物体细胞杂交”、“混合气体”、“天然成分”、“核心”、“工具酶”知识依据单克隆抗体、植物体细胞杂交、动物细胞培养、转基因完整分析单克隆抗体的制备首先是将经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，其诱导方法与植物体细胞杂交不同的是用灭活的病毒诱导。动物体细胞培养需要满足以下条件：无菌无毒的环境、营养、温度和pH以及气体环境。气体环境必须是含95%的空气加5%的CO2，O2是细胞代谢所必需的，CO2是维持培养液的pH。在使用合成培养基培养动物细胞时，由于人们对一些细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此通常需加入血清、血浆等一些天然成分。转基因技术的核心是基因表达载体的构建，用到的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶。1.将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子2.动物细胞融合与植物体细胞杂交的不同项目动物细胞融合植物体细胞杂交原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性及细胞的全能性诱导手段除物理、化学方法外还可用灭活的病毒物理、化学方法酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶纤维素酶和果胶酶结果杂种细胞群杂种植株应用制备单克隆抗体等培育白菜—甘蓝等一、选择题1.由于乙肝病毒不能用动物细胞培养，因此无法用细胞培养的方法生产疫苗。自1979年乙肝病毒基因组的DNA测序完成后，已知病毒的核心蛋白和表面抗原蛋白的氨基酸序列。如图所示是应用生物工程技术生产乙肝疫苗的示意图，下列相关叙述中不正确的是（）A.生产乙肝疫苗的过程也达到了定向改造细菌的目的B.用于生产疫苗的目的基因为编码核心蛋白的基因C.在②过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶D.用于生产疫苗的目的基因为编码表面抗原蛋白的基因解析基因工程能定向地改造生物的遗传性状，题中将乙肝病毒的有关基因引入细菌，从而达到定向改造细菌的目的；乙肝病毒起抗原作用的是其表面抗原蛋白，所以生产乙肝疫苗的目的基因是编码表面抗原蛋白的基因，而不是编码核心蛋白的基因；图中②是将目的基因与载体连接，并将重组DNA导入细菌细胞中的过程，此过程需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。答案B2.（09·浙江金华十校期末）为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。以下说法不正确的是（）A.获得耐盐基因后，构建重组DNA分子需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶B.将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和显微注射法C.由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用植物组织培养技术D.为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的耐盐基因作探针进行分子杂交检测，又要用一定浓度的盐水浇灌方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性解析用限制性核酸内切酶剪切耐盐基因后，还需要用同种限制性核酸内切酶将载体切开，同时还需要用DNA连接酶连接目的基因和载体。将重组DNA导入水稻细胞常用农杆菌转化法，将重组DNA导入动物细胞常用显微注射法。检测目的基因表达与否，可以用分子水平的检测方法，如用耐盐基因做成探针检测受体细胞是否有目的基因，或检测受体细胞是否有目的基因表达产生的mRNA或蛋白质。还可以检测个体是否具有抵抗盐碱溶液的能力。答案B3.（09·南通调研）蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质的原因是（）A.缺乏改造蛋白质所必需的工具酶B.改造基因易于操作且改造后能够遗传C.人类对大多数蛋白质的高级结构知之甚少D.蛋白质中氨基酸的排列顺序千变万化，操作难度大解析因蛋白质