基因工程实验须知

1基因工程实验须知一、每次实验前必须预习实验内容，了解实验的基本原理、操作步骤，禁止不预习就做实验。二、每次实验必须做好实验记录,每次实验完成后，根据记录写出实验报告。三、实验所得结果，如不再供下一次实验用，应交给指导教师，并注明名称、数量、组别、姓名等。四、实验室应经常保持整洁、桌面上不要乱放与本次实验无关的书籍、仪器、药品。火柴头、废纸、废液等应放入废液桶中。倒入水槽中的废液（无污染的）立即放水冲掉。五、爱护仪器、节约药品。仪器损坏后应立即报损，并按规定赔偿。六、试验、药品、公用器具使用后应立即放回原处，注意不要调错试剂瓶塞或滴管,以免污染药品。七、实验室必须安静，不得阅读与本次实验无关的书籍：禁止吸烟及吃食物。八、根据实验记录，及时完成实验报告，不按时交报告者，不予记录实验成绩。九、实验完毕，值日生应将实验室打扫干净，关好水、电、门、窗，离开实验室时，检查一遍，以免发生事故，确保安全。2实验一植物基因组DNA提取目的：了解植物细胞的特点，掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。原理：用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品，提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子，以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用，而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质，从而减少了蛋白质对DNA的污染。然后用CTAB处理，在特定的盐浓度下，CTAB使基因组DNA处于溶解状态，而蛋白质仍为沉淀。经细胞破碎液获得的DNA粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理，其中酚是高效的蛋白变性剂，可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉，然后用氯仿、异戊醇处理，一方面可达到去蛋白的目的，另一方面还可去除残留的酚。一、材料植物的根、茎、叶。二、设备移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。三、试剂1、CTAB或Nacl溶液：4.1克NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10克CTAB，加水至100ml。2、其它试剂：氯仿、异戊醇（24：1），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），异丙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K（20mg/ml），5mol/LNaCl。四、操作步骤1、选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干，用蒸馏水洗两次，然后用超纯水洗一遍，吸干，剪碎称0.5-0.25克。2、将所取材料放入预冷的研钵（研钵提前要灭菌），研成粉末后置于7ml离心管内（可以换为将样品放置到7ml离心管中800ulＣＴＡＢ后用玻棒捣碎）。3、加入2.4ml65℃预热的CTAB，充分混合后65℃水浴90min以上，冷却到室温，加入等体积氯仿异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min，取上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀，-20℃度放置20min，4℃离心35000g×5min，去上清。4、再沉淀中加入0.6ml的65℃CTAB温育30min，待沉淀充分溶解，加入等体积氯仿异戊醇充分混匀，4℃离心6000g×5min，去上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀-20℃放置20min。4℃离心5000g×5min，去上清。5、用70%乙醇清洗沉淀两次，真空抽干，加入200μlTE溶解DNA后置于4℃备用6、提示：酚、氯仿、异戊醇的作用：酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。变性蛋白质的密度比水的密度大，经过离心与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开，而酚与氯仿有机溶剂比重大，保留在最下层。作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊。酚的变形作用大，但酚与水能有一定程度的互溶，因而损失了这部分水相中的DNA。氯仿的变形作用不如酚效果好，但氯仿不与水相容，不会带走DNA，所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带去。也可以在第二次抽提时将氯仿与酚混合(1:1)使用。异戊醇能降低分子表面的张力，可以减少抽提过程中的泡沫产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4实验二基因的PCR扩曾反应（聚合酶链式反应）目的：学习PCR反应的基本原理及相关实验技术原理：聚合酶链式反应（PCR，polymerasechainreaction）实质是体内DNA复制的体外模拟。当双链DNA变性为单链以后，DNA聚合酶以单链DNA为模版，并利用反应混合物中的四种dNTP，以与模板互补的寡聚核苷酸链为引物，合成新的DNA互补链。新合成的DNA链的起点，由加入在反应混合物中的一对寡聚核苷酸引物在模板DNA链两端的结合点决定，经过PCR的循环即模板DNA变性为单链、引物与模板退火（杂交）、DNA合成三步骤的反复重复，最后，两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数在理论上可扩增达2n，使特定的DNA区段得到迅速、大量的扩增。经过30~35个循环，可将2kb的DNA从1pg扩增到0.5-1μg，能够通过琼脂糖凝胶电泳检测出来。转基因植物由于含有目的基因，当用针对目的基因来说为特异的一对寡聚核苷酸链作为引物，对其总DNA作PCR时，可以得到特异性产物（目的基因），而非转基因植物的总DNA不会扩增出特异性产物。一、材料待扩增的基因样品二、设备基因扩增仪(PCR仪)，台式离心机，电泳仪，紫外监测仪三、器皿微量移液器，微量离心管（0.5ml），微量吸头（Tip头），电泳槽四、试剂Taq酶，dNPT，10×Taq酶buffer，特异寡聚核苷酸引物（primer），模板DNA，无菌去离子水，无菌矿物质油，琼脂糖，溴酚兰指示剂。五、方法1、在0.5ml无菌Eppendorf管中，分别以被检测植物的总DNA、阴性对照、阳性对照DNA为模板，进行PCR扩增反应，并设置两个空白对照：没有DNA和没有引物的。5向各管中依次加入下列试剂（总的反应体积为50μl）：无菌去离子水33~32μl1xTaq缓冲液5μldNTP（各2.5mmol/μl）5μl引物R（20pmol/μl）2.5μl引物F（20pmol/μl）2.5μl模板DNA1~2μl（含质粒DNA0.01~0.1μg或含植物总DNA0.05~0.5μg）将以上各试剂（Taq酶除外）混匀后于94℃变性10min，取出离心管，快速离心几秒钟，使冷凝于管盖上的液体回到管底部，再加入1μlTaqDNA聚合酶（约2~3U），混匀后吸取少量灭菌的矿物质油覆盖于页面上。使用待加热帽的PCR仪时不必家矿物油。2、设置PCR的循环程序，以下循环参数可作为参考：98℃预变性2min；94℃变性30~60s；53~57℃退火1min；72℃延伸1~2min，循环25~35次后，72℃延伸10min（以保证扩增出来的片段都是全长的），扩增反应完全后，取样品反应液5~50μl，用合适的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的结果并照相。提示：1、防止污染：由于PCR反应的高灵敏性，所以在操作中要严防环境DNA污染，全部器皿均要求灭菌，最好戴一次性手套进行操作，矿物油要分装，一次用一支。为防止交叉污染，最好所有PCR试剂都事先分装成小份备用。装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在离心机上作瞬时离心，这样可减少污染机会。一般最后加模板DNA，且加样时忌形成喷雾，所有非即用管都应盖严。只要有可能，就应设置阳性对照（即由少量适当的靶序列参与的PCR）和一个空白对照（不含模板DNA的PCR），以检测PCR反应系统是否正常。2、反应系统组成（1）引物在PCR中的浓度常是1μmol/L，这一浓度足以完成30个循环的扩增反应，更高浓度可能导致出现意外的非靶序列的的扩增。如果引物的浓度不足，6则PCR的效率极低。（2）TaqDNA聚合酶催化以典型的PCR反应所需酶量约为2U。酶量少，扩增效率低；酶过量，则可能导致非靶序列的扩增。（3）dDNA系在饱和浓度（每种dDNA20μmol／L）下使用。（4）靶序列：含有靶序列的DNA以单链或双链形式加入到PCR混合液中。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此用质粒作反应模板时最好先将其线状化。模板DNA中靶序列的浓度因情况而异，可按已知靶序列量递减（1ng，0.1ng，0.01ng等）的方式设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。3、一般来说，模板的作用量越多，PCR的效率相对也高一些，但有一定的限制，特别是在模板DNA质量不太好，杂质含量比较多时，模板增多反而会影响PCR的结果。4、若PCR产物呈降解片段首先减少模板DNA用量。5、PCR产物非特异性条带较多应首先提高退火温度，其次减少引物的用量。有时可以用首次PCR的产物为模板进行再次PCR以得到专一的特异性条带。7实验三碱法小量制备重组质粒目的：掌握最常用的提取重组质粒的方法。原理：从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法很多。其分离可依据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性提取法，羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、两相法等。其中碱变性法提取效果良好，既经济且收得率较高，提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。碱变性抽取质粒DNA是基于染色体DNA于质粒DNA的变形与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体的氢键断裂，双螺旋结够解开而变性。质粒DNA的大部分液断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAC高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成的缠连得网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。一、材料LB培养基上生长的菌落二、设备振荡培养箱、微量离心管、台式高速离心机、恒温高速离心机、冰箱、微型电泳槽三、试剂准备1、溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0）。1MTris-HCl（pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高温高压灭菌15min，贮存于4℃。2、溶液Ⅱ：0.2NNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。3、溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液（pH4.8）。5MKac300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml、4℃保存备用。84、TE：10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）。1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml9、RnaseA（RNA酶A）：不含DNA酶（Dnase-free）RnaseA的10mg/ml，TE配置，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。10、6×loadingbuffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖于三角烧瓶中，加20ml1×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TAE），即可上样。四、操作步骤1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mlLB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜（约