基因工程综合性教学实验

基因工程综合性教学实验大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因克隆表达纯化吴海珍王善利赵健俞建瑛张惠展华东理工大学应用生物学系二○○五年一月第一部分碱性磷酸单酯酶基因的定位、克隆与表达实验流程图碱性磷酸单脂酶基因在染色体DNA上的杂交定位――SouthernBlotting碱性磷酸单脂酶基因的体外扩增――PCR扩增PCR体外扩增片段的克隆连接于T-载体――连接连接产物转化大肠杆菌受体菌――转化转化子质粒DNA的抽提――快速法制备质粒转化子的鉴定――限制性内切酶酶切目的转化子DNA的大量制备――碱法抽提质粒DNA酶切回收克隆的目的基因片段――回收目的基因重组表达型质粒的构建――连接、转化、鉴定重组大肠杆菌目的蛋白的表达――蛋白电泳实验路线E.coliChromosomalDNAE.coliChromosomalDNAAApMD18-T杂交定位phoAPCR扩增1.5kbTT连接转化划线扩增转化子快抽质粒酶切鉴定KpnIBamHISacIEcoRIXbaIHindIIISphIAccIPstISalI4.1kbpMD-phoAreplacZphoAAprNdeI0NdeIEcoRI1197SphI1415BamHI1550KpnIBamHISacIEcoRIXbaIHindIIISphIAccIPstISalI4.1kbpMD-phoAreplacZphoAAprNdeI0NdeIEcoRI1197SphI1415BamHI1550EcoRI0.4+3.7kb1.4+2.7kbSphI1.2+2.9kb0.2+3.9kb(1)(2)(1)(2)NdeI/BamHIBamHINdeI1.5kb电泳回收pET-11a5.6kbT7orilacIBamHINdeISphIPstIHindIIIAprXbaI连接、转化、扩增和鉴定pET-11a:phoA7.1kb重组菌发酵、表达产物纯化与测活目的蛋白1DNA的酶切摘要本单元主要介绍限制性核酸内切酶的各种特性、酶的保存方法和使用注意点，多种酶联合酶切的常用策略等。1.1实验原理DNA重组技术中的第一步是从不同来源的DNA（染色体DNA或质粒DNA）上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相对应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。限制性核酸内切酶几乎存在于任何一种原核细菌中，它能在特定位置上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。早在20世纪50年代初微生物体内的限制核修饰作用就已发现，10年后细菌的限制和修饰作用的分子机制被阐明。以大肠杆菌为例，在K株和B株中都含有各自不同的限制――修饰系统，两种不同来源的－噬菌体（K和B）长期寄生于各自的宿主细胞中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性的保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点，故它们在感染相应的宿主细胞（K株和B株）时DNA不被降解，因此感染频率很高。当它们分别感染其他宿主细胞时，由于没有特异性的保护作用，入侵的DNA分子被宿主细胞的限制性内切酶切割降解，从而感染频率急剧下降，普遍能低一或几个数量极。这一现象普遍存在与原核细菌中。但由于宿主细胞内的降解作用的不完全，入侵的DNA分子总有极少数能完整保留下来并得以在细胞体内复制，而且在复制过程中被宿主细胞的甲基化酶所修饰。这修饰过的DNA分子再重新制备后导入该宿主细胞时，感染频率又能恢复到原来的高位，即限制――修饰作用被解除。1.1.1限制性核酸内切酶的分类目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类（见表1-1）。其中II类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于DNA的重组实验。I类和III类酶严格地说应该称为限制――修饰酶，因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位，包含在同一酶分子中。表1-1各类限制性内切酶的特性I类酶II类酶III类酶酶分子三亚基双功能酶内切酶和甲基化酶分开二亚基双功能酶识别位点二分非对称序列4～6bp短序列，大多数为回文结构5～7bp非对称序列切割位点距离识别位点至少1000bp，无特异性在识别位点中或靠近识别位点在识别位点下游24～26bp处限制性反应与甲基化反应互斥分开的反应同时竞争限制作用所需的辅因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（非必需）DNA重组中的用途无有无1.1.2II类限制性核酸内切酶的基本特性II类限制性核酸内切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血杆菌d型菌株中发现的。该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组实验中广泛使用。目前已分离出400余种II类限制性核酸内切酶，鉴定识别及切割位点的有300多种，商品化的酶NEB（NewEnglandBiolabs）公司品种最多，达220余种，其中在DNA重组实验中常用的有20多种。这些酶的统一命名由酶来源的生物体名称缩写构成（见图1-1）生物体属名的第一个大写字母生物体种名的前两个小写字母生物体菌株株名或质粒名（非必需）生物体中发现限制性酶的次序12345HindIII:Haemophiliusinfluenzaed中发现的第三个限制性内切酶酶EcoRI:Escherichiacoli中发现的第一个限制性内切酶酶，编码基因在抗药性质粒R上SacI:Streptomycesachromogenes中发现的第一个限制性内切酶酶图1-1限制性内切酶的命名原则与示例1.1.2.1识别位点II类限制性内切酶的识别位点具有180°旋转对称的回文结构，常用的识别序列往往为6个碱基对，例如HindIII的识别序列：5'-AAGCTT-3'3'-TTCGAA-5'其中一部分的识别序列某一或某两位碱基并非严格专一，但都在两种碱基中具有可替代性，这种不专一性并不影响内切酶和甲基化酶的作用位点，只是增加了DNA分子上的酶识别与作用频率，例如AvaI的识别序列就是典型的结构：5'-CCCGGG-3'3'-GGGCCC-5'TATA有的酶识别位点为4或5碱基对，如AluI、HaeIII和Sau3AI（见图1-2）等，在DNA上的出现频率则较高，而象Sau3AI切割DNA后产生的是粘性末端，且与BamHI切割后的粘性末端相同，为大规模克隆提供了可能。实际应用中利用Sau3AI高频现象，结合DNA的部分酶切策略进行研究也是常用的实验手段。5'-AGCT-3'3'-TTCG-5'5'-GGCC-3'3'-CCGG-5'5'-GATC-3'3'-CTAG-5'AluIHaeIIISau3AI图1-2限制性内切酶的命名原则与示例另外一些不常见的酶识别位点相对较长，在DNA链上出现频率也相对较低，如FseI（5’-GGCCGGCC-3’），出现频率为1/48=1/65kb。实际上由于不同生物体的DNA碱基含量不同，酶的识别位点的分布和频率也不同。大肠杆菌基因组中AT含量较丰富，所以富含AT的识别序列（如DraI：5’-TTTAAA-3’；PshBI：5’-ATTATT-3’；SspI：5’-AATTAA-3’）较为频繁的出现，而链霉菌基因组因GC含量高，相应的富含GC碱基对的识别序列（NaeI：5’-GCCGGC-3’；SmaI：5’-CCCGGG-3’；SacII：5’-CCGCGG-3’）较常见。1.1.2.2粘性末端限制性内切酶切割DNA产生的末端根据被切开的DNA末端性质的不同（不考虑碱基序列）可分两大类：平端和粘端，而后者又可分为3’-OH突出或5’-P突出两种，分布情况见图1-3，故DNA分子的连接通常发生在同种限制性内切酶酶切后的DNA间。（3）3'粘性末端PstI（2）5'粘性末端HindIII（1）平头末端EcoRV5'---GATATC---3'3'---CTATAG---5'5'---GAT3'---CTAATC---3'TAG---5'+5'---AAGCTT---3'3'---TTCGAA---5'5'---A3'---TTCGAP5'OH3'AGCTT---3'G---5'5'P3'OH5'---CTGCAG---3'3'---GACGTC---5'5'---CTGCA3'---GP5'OH3'G---3'ACGTC---5'5'P3'OH++图1-3DNA酶切产生的三种末端实际上DNA重组应用中，由于不同限内酶酶切能产生相同粘性末端，因此DNA分子的连接可发生在不同限内酶之间，常见的DNA分子连接情况见图1-4。而在重组工作中如没有合适的酶切口产生相同的粘性末端，则可对酶切后的突出粘性末端进行补平，采用平头连接策略。（1）同种酶产生的粘性末端5'---G3'---CCTAGGATCC---3'G---5'+5'---GGATCC---3'3'---CCTAGG---5'（2）不同种酶产生的相同粘性末端BamHI:5'-GGATCC-3'5'---3'---CTAGGATCC---3'G---5'+5'---GATCC---3'3'---CTAGG---5'a：保留一种酶切位点Sau3AI:5'-GATC-3'和BamHI:5'-GGATCC-3'b：原酶切位点消失5'---G3'---CAGCTTCGAG---3'C---5'+5'---GTCGAG---3'3'---CAGCTC---5'SalI:5'-GTCGAC-3'和XhoI:5'-CTCGAG-3'图1-4DNA粘性末端的连接效果1.1.2.3甲基化影响大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coliJM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。1.1.2.4近末端切割基因工程的操作中经常要对DNA片段进行精细切割，在PCR产物中有些甚至只切割一个碱基对。不同的内切酶对裸露的酶切位点不能切断，因此必需在酶切位点外侧加上一个或几个保护碱基，表1-2中列举了常用的十五种内切酶在不同保护碱基下的切割效果，一般保护碱基大于三个碱基对时能完全切割。但是在有些PCR产物中即使保护碱基大于五时也不一定能被有效切断，这可能是PCR产物纯化中残留的杂质影响酶切或是PCR产物末端聚合不完整。表1-2DNA末端酶切位点的切断情况Enzyme末端碱基数0123BamHI-+++BglII--±+ClaI-±++EcoRI-±++EcoRV-+++HindIII---+KpnI--++NcoI--++PstI--±+SacI-±++SalI++++SmaI-±++SphI--++XbaI-±++XhoI--±+-：不能切断；±不能完全切断；+：完全切断1.1.3限制性核酸内切酶的使用限制性核酸内切酶在基因工程属常用工具酶，主要用于基因物理图谱的绘制、基因片段的鉴定或获得、用于杂交的DNA探针的制备等，而酶切的条件控制则是非常重要的。1.1.3.1作用条件在DNA的酶切反应中酶切条件是酶切成功的关键，主要影响因素有：（1）反应温度常规酶切反应均在37℃进行，但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如SmaI，最适反应温度为30℃，故最好根据所选用的酶确定反应温度。当采用联合酶切进行实验时尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切（见1.1.3