CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1、从新活化的E.coliDH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5mlLB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5mL离心管中；3、培养物于冰上放置20min；4、0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞,冰浴20分钟；5、0～4℃，4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；6、0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入100µL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%-20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。注意事项1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；