第6章--高效毛细管电泳

•1937年，瑞典科学家蒂塞利乌斯（Tiselius）设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，用于牛血清中分离血清蛋白、α-、β-和γ-球蛋白，并于1948年荣获诺贝尔化学奖。多年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。•各类电泳技术已广泛应用于生命科学•毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指离子或带电粒子以毛细管为分离介质，以高压直电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。•采用了0.05mm内径的毛细管；•采用了高达数千伏的电压。4毛细管电泳：毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指离子或带电粒子以毛细管为分离室,以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是CE和传统电泳技术的根本区别。传统电泳：受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低。传统电泳与毛细管电泳的区别：5同：均为液相分离分析方法。可用相同的理论来描述（差速迁移），一些色谱名词概念，如：塔板理论、速率理论、保留值等仍可使用。异：分离原理不同；仪器构造有很大的差异。HPLC示意图CE示意图61、毛细管电泳柱效更高，塔板数可达105~106/m，（又称高效毛细管电泳，HPCE）；2、分离速度更快；3、溶剂、试样消耗极少，（纳升级）；4、仪器成本低，（不需要高压泵）；5、选择性高。通过选择操作模式和缓冲溶液的成分以达到对性质不同的成分的有效分离。6、应用广泛。特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质和核酸等生命科学领域的测定，以后逐渐被广泛应用于生物，化学，医药，环保等领域。与HPLC互相补充，共同成为分析化学中重要的分离分析技术。三、毛细管电泳的特点和分类（一）毛细管电泳的特点7（二）毛细管电泳的分类按毛细管中填充物的性质分类：自由溶液毛细管内填充物为pH缓冲的电解质溶液。如：毛细管区带电泳（CZE）。非自由溶液毛细管内填充物为凝胶或其他筛分介质。如：毛细管凝胶电泳（CGE）。按分理机制分类：电泳型:CZE、CGE、NACE（非水）色谱型:胶束电动毛细管色谱（MECC）微乳液电动毛细管色谱（MEECC）电泳/色谱型:毛细管电色谱（CEC）（一）基本概念毛细管总长度(L,cm)毛细管有效长度(l,cm)毛细管的入口端到检测窗口的距离；迁移时间(t,min)带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；电泳速度（vcm/s）在单位时间内，带电粒子定向移动的距离；电场强度(E,V/cm)电场强度/毛细管总长度；电泳淌度（μcm2/(V·s)）带电粒子在毛细管中定向移动的速度与所在电场强度之比；9一、电泳和电泳淌度（mobility）电泳速度（uepcm/s）：在单位时间内，带电粒子在毛细管中定向移动的距离。电泳淌度（μepcm2/(V.s)）：带电粒子在毛细管中，单位电场强度下、单位时间内定向移动的距离。LVμEμuepepep电泳：在电场作用下，带电粒子在缓冲溶液中的定向移动。或：单位电场强度下的电泳速度。E：电场强度；L：毛细管长度；V：毛细管两端施加电压10ηεζ4πiepζ:粒子的Zeta电势；与粒子表面的电荷密度有关，近似正比于Z/M2/3；η:介质的粘度。ε:介质的介电常数；电泳淌度11epiiieffμγαμ有效淌度μeff、有效电泳速度ueff：考虑实际溶液中，溶质分子的离解程度，离子的活度系数对离子淌度的影响。溶质分子的i级离解度；ii综上所述：荷电粒子在电场中的迁移速度，除与电场强度和介质特性有关外，还与粒子离解度、电荷数以及粒子的大小和形状有关。离子的活度系数。Eμueffeff当固体与液体接触时，固体表面带一种电荷，因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-，管内壁带负电荷，形成双电层后，电渗流方向为由正极到负极。电渗流形状：平头塞状Si－O－在电场中，液体相对毛细管内壁的移动均为向负极方向的移动，电渗速度是电泳速度的5～7倍，因此无论是正离子、负离子还是中性分子，都将随着电渗流朝着一个方向移动。电渗与电泳作用的对象不同:电泳——荷电粒子电渗——溶液（缓冲溶液，pH2）电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；（1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；CE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；5.添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂可控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流减小。20（二）谱带展宽影响谱带展宽的原因有两类：①毛细管柱内的溶液和溶质。包括：自热、扩散和吸附。②仪器系统。包括：进样系统和检测系统。1.电渗流型HPCE（a）和HPLC（b）柱中溶液流型的比较ab㈩㈠高压低压21电渗流型的特点：扁平型的塞子流。是毛细管电泳高柱效的重要原因。毛细管电泳的速率方程：uDH/2毛细管电泳无固定相，所以不存在涡流扩散相和传质阻抗相，只有纵向扩散相。DuLHLn2//ddD：组分的扩散系数DELnd2/ap理论塔板数与电场强度成正比。E越高越好？？222.自热电流通过缓冲溶液时将会产生焦耳热（或称自热）。●与施加的电场强度有关；●与毛细管内径有关；内径越小，自热就越小，（常用25~75μm）。●与介质的浓度有关。自热过大将会破坏扁平型塞子流，使柱效降低。自热与哪些因素有关呢？150031Edc自热造成的柱效降低较小c：介质的浓度当23自热是如何影响柱效的呢？自热如何产生的呢？……由于焦耳热通过管壁向环境散热，因此在毛细管内形成径向温度梯度。温度径向梯度将会导致缓冲溶液的径向粘度梯度，从而产生离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏了扁平型塞子流的形状。毛细管横切面示意图内腔弹性熔融石英聚酰亚胺层聚酰亚胺层的作用：增加弹性，不易折断。24为了降低温度差，可采取以下措施：①减小毛细管内径，常用25~75μm。不能太小，否则会对进样和检测带来困难，并且易造成柱堵塞。②增加壁厚（375μm）。③降低聚酰亚胺涂层的厚度。④降低缓冲溶液的浓度。⑤采用冷却系统。25内半径（μm）壁温度（K）温差（K）25299.00.5350301.21.3975304.23.14100307.75.58125311.68.72不同内径毛细管的管壁温度及其轴心与管壁的温差263.扩散与吸附纵向扩散：md22/2DtuDLσ：标准偏差D：溶质的扩散系数（随分子量的增加而降低）tm：迁移时间。影响迁移时间的因素（参数）毛细管长度外加电压缓冲溶液的种类等扩散27吸附熔融石英内壁表面对溶质分子的吸附作用。解决办法：内壁涂层（或键合）如：聚乙烯亚胺（PEI）涂层甲基硅烷化键合：Si－O－HSi－O－Si－C或Si－C－定性和定量：保留时间和峰面积（峰高）色谱过程动力学之塔板理论•毛细管区带电泳(CapillaryZoneElectrophoresis，CZE)•毛细管胶束电动色谱(MicellarElectrokineticCapillaryChromatography，MEKC，MECC)•毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）•毛细管等电聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing，CIEF）•毛细管等速电泳（CapillaryIsotachorphoresis，CITP）毛细管电动色谱（CapillaryElectrokineticChromatography，CEC）第三节毛细管电泳的主要分离模式31一、毛细管区带电泳（CZE）毛细管自由溶液区带电泳应用实例1：32应用实例2：33蛋白质肽片段混合物酶切CZE分离特征性肽图微量制备CE分别测定各片段的氨基酸序列整个蛋白质的一级结构蛋白质分析：34二、胶束电动毛细管色谱（MEKC）溶质缓冲溶液胶束（假固定相）35三、毛细管凝胶电泳（CGE）综合了CE和平板凝胶电泳的优点，是当今分离度极高的一种电泳分离技术，特别适用于蛋白质、多肽、寡核苷酸、DNA等的分离分析，特别是与激光诱导荧光（LIF）检测技术结合，成为DNA快速序列分析的优选方案，在人类基因工程计划中发挥重要作用。两种机理：电泳分子尺寸聚丙烯酰胺凝胶（PAG）（交联和非交联）凝胶种类琼脂糖、甲基纤维素及其衍生物葡聚糖、聚乙二醇等原则上是按照分子大小分离36四、毛细管电色谱（CEC）两种机理：电泳色谱根据组分在流动相和固定相中分配系数的不同和自身电泳淌度的差异进行分离。五、非水毛细管电泳（NACE）解决了一个问题：样品溶解问题；条件：有机溶剂中须加入电解质，选择上比较困难；比水溶液体系可承受更高的操作电压产生的高电场，因而会有更高的分离效率。37第四节毛细管电泳仪基本结构：高压电源、进样、填灌/清洗、毛细管温控、检测、记录/数据处理毛细管电泳仪示意图38一、高压电源包括：电源、电极、电极槽0~±30kV,精度1%电极，铂丝（0.5~1mm）电极槽高压危险！！保护！39二、毛细管柱1.材料玻璃：早期使用，现已淘汰。电渗太强，对紫外光有吸收，并且杂质较多。机械强度低，易折断。聚四氟乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和聚丙烯：机械和化学性能稳定，对近紫外光和可见光透明，电渗较低。缺点：样品吸附较强，热传导差，管内径不易均匀。40石英：金属杂质少。能够透过短紫外光，拨去一小段（约1cm）聚酰亚胺层后，即可作为光学检测器窗口。机械强度高，不易折断。表面存在硅醇基，产生氢键吸附，并产生电渗流。2.内径和长度CE实现高电场的关键部件是小孔径毛细管柱。在相同的电压下，孔径越小，电流就越小，产生的焦耳热量就越少。另外，孔径越小，散热效果也越好，柱效提高。41那么，是否孔径越小越好呢？虽然已有用2μm的报道，但是孔径小，样品负载小，检测困难，也增加了进样、清洗等操作上的困难。常用25~75μm，最常用的是50μ