小白鼠染色体标本的制作、染色与观察

小白鼠染色体标本的制作、染色与观察姓名：学号：实验时间：2014.12.2~2014.12.91.实验目的（1）初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法，了解各操作步骤的原理。（2）了解常用实验动物染色体的数目及特点。（3）认识不同生物染色体的特征。2.实验原理凡处于活跃增殖状态或者经过各种处理，任何动物组织的细胞都可进入分裂时期，均可用于染色体分析。在正常动物体内，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。给动物注射一定剂量的秋水仙素，即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点：①用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处；②用低渗法使细胞膨胀,以至于在滴片时细胞胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上；③空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。Giemsa染色是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。主要用Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。3.实验材料和用品（1）材料：小白鼠（2）试剂：秋水仙素、生理盐水（0.9%的NaCl溶液）、0.3%KCl低渗溶液、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液（3）器材：解剖盘、解剖镊、解剖剪、小烧杯（×2）、吸管、玻璃刻度离心管、恒温水浴锅、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等4.实验步骤（1）小白鼠染色体标本制作①取雄性小鼠以每克体重4μｇ注射秋水仙素，经14～16小时后，断头法杀死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl）洗去血污。②放入装有1ml0.3%KCl液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。③用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml。④37℃静置30分钟，进行低渗处理。⑤以800～1000转/分离心8分钟。⑥弃上清液，加入2ml甲醇·冰醋酸固定液（3：1），并用吸管至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8分钟。⑦再以800～1000转/分离心8分钟。⑧弃上清液，加1ml固定液，再制成细胞悬液，固定5分钟。⑨取洁净的低温预冷载片，距载片10～15cm高度滴下2～3滴细胞悬液，从载片一边向另一边轻轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。⑩用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥或成文火干燥。（2）小白鼠染色体标本染色与观察①倒置染色法——在玻璃板上用废旧载玻片作支架，使标本载玻片的标本面向下放置到支架上，在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液。目的一可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。②用Giemsa染色20～30分钟，细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。③镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。5.实验结果此图是经秋水仙素处理的小鼠精细胞染色体标本照片,数数发现有36条染色体而非40条，可能是应为染色体重叠程度太高而造成计量误差。视野中可见大量的精子，它们有一个比较圆的头部和鞭毛，还有一些细胞有一个尖，那是未变形的精子。部分细胞处于减数第一次分裂中期，这样的细胞是二倍体，应有40条染色体；有些处于减数第二次分裂中期，这样的细胞是单倍体，应有20条染色体。还有一些细胞处于分裂期，但不是中期，这类细胞染色体的凝集程度不是很高，呈丝状。处于减数分裂中期的染色体染色质凝缩程度达到最大。小鼠的染色体多为端着丝粒染色体，呈“V”字形或“U”字形，染色体呈短棒状。6.讨论与结论（1）向小鼠腹腔注射秋水仙素时，用左手抓住小鼠背部的皮，右手持注射器，进针时倾斜45°，在开始注射前，将针头略向上挑，以免将秋水仙素注入小鼠的肠道内。注射过程中注意观察小鼠的反应。如果秋水仙素被正确注入腹腔内，小鼠应该是很安静的。（2）断头法处死小鼠后，血液要冲洗干净，以免影响实验观察。（3）从开始加入0.3%KCl低渗溶液第一次离心前，时间最好控制在50-60min。过滤出来的如果不是乳白色悬浊液就再过滤一次。（4）两次离心的转速控制在800～1000转/分，不要太高，以免破碎细胞。第一次离心去上清液加固定液时时不要过分吹打，第二次离心后要充分将细胞吹开。（5）滴片时，使滴管与载玻片间的距离尽量远，这样细胞才能被“摔碎”，这一点十分重要，从实验结果看来，低渗使细胞破碎效果并不佳，通过摔碎细胞，让染色体更容易辨认，否则，细胞整个将成蓝色圆状，而膜内物质看不清。（6）滴完片之后，将载玻片的一端轻轻在试验台边缘敲打，使未破碎的细胞破碎。（7）边敲打载玻片边从载玻片一边向另一边轻轻吹气，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。（8）多个样品同时进行染色时，载玻片应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。染色时间30分钟左右。（9）冲洗载玻片时从背面冲洗。（10）已知小鼠染色体的数目为40条，如果实验所得结果远小于这个数值，分析原因可能有二：①在滴片、染色、冲洗等步骤中操作不当，造成染色体丢失；②该细胞处于第二次减数分裂中期，染色体总数为20。③染色体重叠程度太高而造成计量误差。（11）不同动物的染色体条数：猫38，小鼠40，大鼠42，兔44，人46，马64，鸡78，狗78。（12）染色体有三个重要特征：①数目；②形态（主要是着丝点位置，有中部、亚中部、端部、亚端部）；③大小（相对长度）。生物分类时，先观察染色体条数，再观察染色体形状，从而判断生物种类。（13）凝集素（PHA）有促凝集和促分裂两个作用。（14）在20对小鼠染色体中，有18对染色体的着丝点是端着丝点，染色体呈“U”或“V”型，第17、18对染色体有一点小短臂。（15）冷的载玻片可以起到减小表面张力的作用，铺散细胞。