生理指标测定方法

一、脯氨酸的测定方法：在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。一、原理用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。（二）仪器设备：1.722型分光光度计；2.研钵；3.100ml小烧杯；4.容量瓶；5.大试管；6.普通试管；7.移液管；8.注射器；9.水浴锅；10.漏斗；11.漏斗架；12.滤纸；13剪刀。（三）试剂1.酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2.3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3.冰醋酸；4.甲苯。三、实验步骤1.标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。2.样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重（g）。二、丙二醛含量的测定1.原理植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532nm处有一吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。由于醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450nm处有一吸收峰，用双组分分光光度法加以排除。2.步骤试剂：（1）10%三氯乙酸（TCA）：TCA--------------25g加ddH2O至---------250ml（2）0.6%硫代巴比妥（TBA）：TBA------------0.6g加5%TCA至---------100ml实验步骤：（1）称取材料0.1g，加10%TCA2ml研磨至匀浆，再加8ml进一步研磨；（2）4000rpm离心10min，取上清至新管；（3）2ml提取液+2ml0.6%TBA，混合均匀，2mlddH2O+2ml0.6%TBA为空白对照；（4）混合沸水浴15min，冰上冷却；（5）4000rpm离心10min；（6）取上清再532nm，600nm，450nm波长下的光密度值。3.计算方法式中，Vt：提取液总体积（mL）----------------10ml；Vs：测定用提取液体积（ml）-------------2ml；FW：样品鲜重（g）---------------------0.1g。三、转基因植株离体条件下失水速率统计将四叶期植株的地上部分剪下，置于室温条件下，分别在不同的时间点（0、0.5、1、2、4、6、8、12和24h)称量植株的重量，统计其失水速率的快慢。失水率的计算公式为：失水率Y(％)=(X0-Xn)/X0×100X0：开始植株的重量；Xn：某时间点植株的重量。四、相对电导率的测定植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常情况下细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境（如高温或低温、干旱、盐渍、病原菌侵染后）影响时，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关，所以被作为植物抗逆性的一项指标。相对电导率的测定步骤如下：（1）取0.1g对照和PEG6000处理的转基因水稻阴性对照和转基因株系三叶期叶片，切成小段，每种处理三个重复；（2）用双蒸水冲洗叶片几遍，除去叶片表面附着的电解质；（3）加10ml双蒸水,在恒温箱中25℃振荡温育1小时，期间经常摇动，测定此时的电导率记为C1；（4）将盛有水稻叶片的试管100℃煮沸15min，冷却到室温后测定，此时的电导率记为C2；（5）相对电导率根据公式计算：Relativeionleakage=(C1-C0)/(C2-C0)×100