实验：计数法测定细胞生长曲线

1实验内容：计数法测定细胞生长曲线作者：王卫东实验日期：2001.10.24-2001.10.31实验目的：学习细胞计数的方法；熟悉测定生长曲线的基本原理、方法，了解其应用。实验原理：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止生长，进入平顶期，然后退化衰老。典型的生长曲线即可分为潜伏期、指数生长期、平顶期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相（潜伏期、指数生长期和平顶期）是每个细胞系所共有的特征。通过测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。本实验采用计数法测定细胞生长曲线，通过连续对细胞计数（通常为7d，一般应每次计数3瓶细胞取平均值），然后以存活细胞数对培养时间作图，即得该种细胞的生长曲线。仪器、材料和试剂：1、仪器：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、血球计数板2、材料：培养瓶、试管、吸管、移液管、废液缸、HeLa细胞、盖玻片、酒精灯3、试剂：培养基（含小牛血清）、0.25%胰蛋白酶实验步骤：1、细胞悬液制备：取生长良好接近汇合的HeLa细胞，胰酶消化，再加新鲜培养基制成细胞悬液后计数。2、接种：根据细胞计数结果，按每瓶5×104个接种细胞（加3mL培养基，实际接种每瓶5.9×104个）作传代培养（理论上应该每人接种21瓶细胞，每天取3瓶计数，但实际每人只接种7瓶）。3、计数：24h后开始作细胞计数，以后每隔24h计数一次，连续计数7天。4、绘图：根据计数结果，绘制HeLa细胞生长曲线。结果与讨论：1、细胞计数结果如下：天数01234567细胞数（万/瓶）5.912246693321318210细胞数（万/mL）1.94822311071067022、绘制生长曲线如下：3、分析与讨论由上图可以看出，实际所得生长曲线与理论生长曲线有一定差距，主要表现在潜伏期和倍增时间不明显。这可能是由于计数误差造成的。⑴、理论上应该每人接种21瓶细胞，每天取3瓶计数，但实际每人只接种8瓶，每天仅计数一瓶细胞，无平行样品取平均值来消除误差。⑵、每瓶细胞也没有重复计数2-3次。⑶、未做染色，有时死活细胞区分不清，可能导致计数不准。⑷、由于操作不熟练，胰酶消化时间控制不当（过长或过短）也能导致细胞计数误差。HeLa细胞生长曲线482231107106700204060801001201234567天数细胞数（万/mL）系列1