01-中性粒细胞功能测定

实验一、中性粒细胞吞噬功能测定AssayforPhagocytosisofPolymorphonuclearLeukocyte•掌握中性粒细胞吞噬功能试验的原理；•熟悉中性粒细胞吞噬功能试验的操作方法；•通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。【实验目的】【实验原理】血液中的中性粒细胞通称小吞噬细胞，具有吞噬细菌和异物颗粒的能力，在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒在一定条件下共同孵育后，显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物颗粒。计数吞噬率和吞噬指数，可反映中性粒细胞的吞噬功能。有助于对疑有吞噬细胞功能障碍的疾病作出诊断。【材料和试剂】1.待测样本新鲜抗凝静脉血2.被吞噬物灭活白色葡萄球菌菌液（6×108/ml）。3.试剂无菌生理盐水，甲醇，瑞氏－吉姆萨染液。4.器材EP管，75%酒精棉球、载玻片，微量移液器、恒温箱，显微镜（香柏油，二甲苯）等。【操作步骤】1.白色葡萄球菌液制备。（已制备好）2.待测血标本制备：静脉采血5ml。3.在EP管内加40微升血液，20微升菌液，混匀。4.将EP管置37℃温育30min，每隔10min混匀一次。5.取一小滴上述混合液，置于载玻片上，推成薄血片，晾干。6.甲醇固定4-5min，滴加瑞氏-吉姆萨染液A液2-3滴，染色1-2min，再B液2-3滴，染色5-10min，水洗，晾干。7.油镜下计数中性粒细胞(＞100个)、吞噬的细菌总数。【推血片方法】•取血混合液一小滴，放于载玻片的右端。将推片置于血滴前端，与载玻片接触，成30°～40°角•向后拉动推片，使与血液接触•待血液扩散形成一条线之后，以均速轻轻向前推动推片，则血液均匀地被涂于载玻片上而形成一薄膜。•取两张无油脂的洁净玻片，左手拇指及中指夹持载玻片，右手持推片。30°血滴越大，速度越快、角度越大--血膜越厚良好的血片，血液应分布均匀，厚度适当。对光观察时呈霓红色，血膜应位于玻片的中央，血膜两端留有空隙，以便注明病例编号、日期等。•保护：双手取显微镜，一手握臂，一手托底•对光：升聚光器打开光栅反光镜采光•观察：标本固定载物台上低倍镜找到标本玻片滴香柏油换油镜目镜观察细调至图像清晰•使用完毕立即用擦镜纸擦干镜头上的油【油镜的使用】EosinophilBasophilMonocyteNeutrophilPlateletRBCLymphocyte胞核胞质直径形状染色质粗糙不匀，排列紧密丰富，含较多细小均匀的紫红色中性颗粒10-15um，为RBC两倍圆形中性粒细胞充满粗大均匀的桔红色嗜酸性颗粒13-15um，略大于WBC圆形嗜酸性粒细胞少，常呈淡红，含少量粗大不均匀紫黑色嗜碱性颗粒10-12um，略小于中性粒细胞圆形嗜碱性粒细胞大，不规则。染色质疏松如网状丰富，染淡蓝，含大量细小嗜天青颗粒，可见空泡15-25um，最大圆形或不规则形单核细胞圆形，偶见凹陷，染色质粗糙致密很少，有的仅在核的一侧出现少量蓝色胞浆6-10um圆形淋巴细胞【血细胞的鉴别】【结果判断】计数200个中性粒细胞，分别记录吞噬细菌的细胞数和每个中性粒细胞吞入的细胞数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数吞噬率＝×100%200200个中性粒细胞中吞噬细菌的总数吞噬指数＝×100%200美兰染色【注意事项】1.所用器材要清洁。2.如细菌数太多可增加稀释倍数作平皿培养后计数。3.血膜必须充分干燥，否则在染色过程中易脱落。4.染液不可过少，以防止蒸发干燥，沉着于血片上不易冲掉。5.冲洗时应以流水将染液冲去，不可先倒掉染液，以免染料沉着于血膜上。6.越接近推片末梢，细胞数越多。计数时应取玻片前、中、后三段计数，以提高准确率。1.简述中性粒细胞吞噬功能测定的原理。2.该实验过程中应注意哪些事项？3.检测白细胞功能的实验还有哪些，各有什么特点？【思考题】