手性分析条件的建立和优化——手性分析中的注意事项(完美版)

1/79大赛璐（中国）手性事业部手性分析中的注意事项手性分析条件的建立和优化2/79内容提纲1.手性HPLC分析条件的建立和优化1-1正相色谱2-2反相色谱2.手性色谱柱的自动筛选3.手性分析中的注意事项3/79Daicel手性色谱柱一览表正相直链淀粉衍生物CHIRALPAK®AD/AD-HCHIRALPAK®AS/AS-H纤维素衍生物CHIRALCEL®OD/OD-HCHIRALCEL®OJ/OJ-HCHIRALCEL®OA,OB,OCCHIRALCEL®OF,OG,OKCHIRALCEL®CA-1反相CHIRALPAK®AD-RHCHIRALPAK®AS-RHCHIRALCEL®OD-RHCHIRALCEL®OJ-RH其它CROWNPAK®CR(＋),(－)CHIRALPAK®OT(＋),OP(＋)CHIRALPAK®WH,MA(＋)CHIRALPAK®QD-AXCHIRALPAK®QN-AX共价键合型－新产品CHIRALPAK®IACHIRALPAK®IB4/79分析条件优化流程图(1)酸性中性碱性1.流动相中添加物的必要性配制流动相Hex/IPA/TFA=90/10/0.1Hex/IPA/DEA=90/10/0.1Hex/IPA=90/10样品5/79碱性样品添加物在分离中的作用mVMinutes0.01.02.03.04.05.06.07.002468101214161820222410.7413.96Hex/IPA/DEA=90/10/0.1流量：1.0mi/min.温度：25℃、检测波长：ＵＶ（254ｎｍ）流动相Hex/IPA=90/10Hex/IPA/AcOH=90/10/0.1流动相Hex/IPA=90/10-0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.35mV024681012141618202224262830Minutes10.940.40流量：1.0mi/min.温度：40℃、检测波长：ＵＶ（254ｎｍ）05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52Minutes0.00.20.40.60.81.01.21.41.6mV0510152025303540酸性样品FCOOHNH2NON（没出峰)（无法分离)6/79添加物的种类和用量样品酸碱性添加物种类添加量中性不需要碱性乙二胺(DEA)(n-丁胺*1)(乙醇胺*2)≦0.5％通常0.1％酸性三氟乙酸(TFA)醋酸≦0.5％通常0.1％*1主要用于1级胺*2主要用于1级氨基醇7/79分析条件优化流程图(2)保留时间?长适宜的分析时间(10-30min.)短增加异丙醇增加正已烷2.配制好流动相选择合适的手性柱分析8/79分析条件优化流程图（3）没有分离部分分离3.选择合适的手性柱尝试别的手性柱OK!基线分离继续优化分析条件分离？9/79筛选结果0510152025303540455055600123456789101112131415Minutes4.684.82OB15mV1234567891011121314Minutes6.716.87OD05101520253035404550556065mV0-505101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52AD05101520253035404550556065mV0123456789101112131415OJmV01020304050607080mV012345678910111213144.7090AS1501020304050607080901000123456789101112131415Minutes4.70OCMinutes1020304050607080mV0123456789101112131415Minutes4.3615OGMinutes001020304050607080mV01234567891011121314Minutes4.36OF色谱条件流动相：Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1流量：1.0ml/min.温度：40℃检测波长：UV254nm样品：FCOOH先择效果最好的手性柱,然后继续优化分析条件10/79分析条件优化流程图（4-A）部分分离A.降低异丙醇浓度B.调整温度C.更换醇类4.分析条件继续优化11/79醇浓度的影响05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52在多数情况下，降低醇的浓度可延长保持时间，改善分离度Column：AD,Temp.：40℃,Flowrate：1.0ml/min.Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1Hex./IPA/AcOH=100/1/0.1-0.50.00.51.01.52.02.53.03.5mV051015202530354045505560Minutes35.7743.71FCOOHSample：Flurbiprofen12/79部分分离B.调整温度C.更换醇类4.分析条件继续优化分析条件优化流程图（4-B）A.降低异丙醇浓度13/79温度的影响Column：CHIRALPAKADMobilephase：Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1,Flowrate：1.0ml/min.25℃40℃Temp.：5℃FCOOH降低柱温会使峰形变宽，但可增大α值升高柱温会使峰形锋利，但α值却变小-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.00123456789101112131415Minutes8.7212.13α:1.59mVMinutes0510152025303501234567891011121314156.667.52α:1.23mV01234567890123456789101112131415Minutes7.669.12α:1.3214/79部分分离C.更换醇类B.调整温度4.分析条件继续优化A.降低异丙醇浓度分析条件优化流程图（4-C）15/79醇种类的影响Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1FCOOHIPA和EtOH有时会使峰形和α值发生明显变化Column：CHIRALPAKADTemp.：40℃,Flowrate：1.0ml/min.Sample：Flurbiprofen05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52a=1.2305101520253001234567891011121314157.589.64a=1.45mVMinutesHex./EtOH/AcOH=95/5/0.116/79正相柱分析条件优化的总结1.根据样品性质判断是否需要往流动相中加添加物2.调整正己烷/醇的比例，从而选择适当的保留时间3.其它优化方法a.流动相的醇浓度降低醇的浓度虽改善分离度，但会延长分析时间b.色谱柱温度升高柱温虽可使峰形锋利，但α值会降低c.流动相中醇的种类改换醇的种类(IPA⇔EtOH)，有时可使分离发生一些变化17/791.手性色谱柱分析条件的建立和优化2-1正相色谱2-2反相色谱2.手性色谱柱的自动筛选3.手性分析中的有关注意事项内容提纲18/79RH系列（反相用）的规格流动相耐压(MPa)温度范围(℃)pH范围OD-RH水溶液/有机溶剂*1=90/10~0/100105～402～7OJ-RHAS-RH5～40*22～9*2,3AD-RH*1有机溶液：醇（甲醇，乙醇，异丙醇）或乙腈*2pH＞7使用时，温度在5～25℃*3pH超过8时，使用硼酸缓冲液19/79根据样品性质选择流动相样品性质OD-RH、OJ-RHAD-RH、AS-RH中性水/乙腈酸性磷酸水溶液(pH2)/乙腈0.1M磷酸缓冲液(pH2)/乙腈碱性0.1MKPF6水溶液/乙腈0.1MNaPF6水溶液/乙腈20mM硼酸缓冲液(pH9)/乙腈20mM磷酸缓冲液(pH8)/乙腈20/79反相流动相的pH值对分离度的影响(AS-RH)OOH中性化合物BenzoinONHOCOOH酸性化合物N-CBZ-Norvaline碱性化合物OfloxacinethylesterONNNFOCOOEt水溶液水溶液/CH3CN=60/40流速：1.0ml/min.水溶液/CH3CN=60/40流速：1.0ml/min.水溶液/CH3CN=80/20流速：0.5ml/min.051015mV02468101214Minutes7.168.77024681012mV012345678910Minutes2.250.01.02.03.04.0mV051015202530354045505560Minutes27.79水磷酸水溶液(pH2)硼酸缓冲液(pH9)051015mV02468101214Minutes7.118.7005101520mV0.02.04.06.08.0Minutes4.174.69020406080mV051015202530354045505560Minutes4.004.484.77051015mV02468101214Minutes6.978.53010203040506070mV012345678910Minutes1.850.02.04.06.08.0051015202530354045505560Minutes30.7436.7821/79有机溶剂种类对分离的影响12.1813.548.208.8411.5212.358.2114.1215.787.457.97水/乙腈=50/50水/乙醇=35/65水/甲醇=25/75OOH2-Methyl-1-tetralone2-Phenyl-2-butanol手性柱：CHIRALPAKAD-RH、流速：0.5ml/min、温度：25℃22/79反相柱分析条件优化的总结1.根据样品性质选择流动相※中性，酸性样品对4种反相柱可使用相同的流动相。但是，碱性样品对OD-RH、OJ-RH组和AD-RH、AS-RH使用的流动相是不同的。2.探索适当的保留时间和流动相组成3.其它优化条件a.水溶液和有机溶液比例多数情况下降低有机溶液的浓度可改善分离性能，但将延长分析时间。b.色谱柱温度升高色谱柱温度会使峰形变得锋利，但会降低α值。c.有机溶剂的种类有机溶剂的种类不同，其洗脱强度也不同。有时其分离效果也发生一些变化23/79内容提纲1.手性色谱柱分析条件的建立和优化2-1正相色谱2-2反相色谱2.手性色谱柱的自动筛选3.手性分析中的注意事项24/79手性色谱柱组合筛选手性色谱柱组合CHIRALPAK®AD-HCHIRALPAK®AS-HCHIRALCEL®OD-HCHIRALCEL®OJ-H手性色谱柱尺寸：0.46cmI.D.×15cmL25/79为何选用AD-H,AS-H,OD-H,OJ-H这4种柱子？２０００～２００４年客户样品分析６６０个样品的分析结果达到基线分离的手性柱比例：基线分离79%（524）部分分离10%（63）不分离11%（73）AD系列、OD系列、AS系列、OJ系列92%（482样品）其他8%（42样品）26/79手性柱：AD-H(25cmL)流动相：Hex/IPA=9/1流速：1.0mL/min.温度：25℃UV波长：254nm标准条件NN手性柱：AD-H(15cmL)流动相：Hex/IPA=9/1流速：3.0mL/min.温度：25℃UV波长：254nm筛选条件柱长（15／25）×流速（1／3）＝分析时间短缩为（1／5）为何选用15cm长度手性色谱柱呢？27/79组合筛选设备ｴﾀﾉｰﾙIPAﾍｷｻﾝ28/79泵检测器色谱柱自动切换阀流动相自动进样器组合筛选设备示意图29/791.用UV检测器只出现“１峰”的时候→应用旋光检测器可确认其分离状况2.可确认其洗脱顺序串联旋光检测器的好处30/79组合筛选设备的程序编制色谱柱流动相