第2章-微生物发酵制药工艺

第2章微生物发酵制药工艺本章内容2.1微生物发酵与制药2.2制药微生物生长特征2.3制药微生物菌种的建立2.4培养基制备2.5灭菌工艺2.6微生物发酵培养技术2.7发酵工艺过程的控制2.8抗生素生产工艺2.9氨基酸发酵生产工艺2.10维生素生产工艺2.1微生物发酵与制药􀂾发酵􀂾发酵制药􀂾发酵制药的基本过程1发酵概念发酵概念：通过微生物培养而获得产物的过程。发酵种类：用产品说明，冠以产物名而成，如青霉素发酵，维生素发酵；发酵工程按需氧分为好氧发酵和厌氧发酵。初级代谢产物：在初级代谢过程中形成的产物，包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。生长所必须的。几乎所有生物初级代谢基本相同。氨基酸，核苷酸，有机酸。次级代谢产物：比较复杂的化合物，不是细胞生长必需的，对生命活动有意义（抗逆境条件）。抗生素，毒素，色素。2、发酵制药概念利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化，获得药品的过程抗生素的发现1928年，英国细菌学家FlemingB发现抗菌物质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14种抗生素，50年代发现了20余种，60年代开始了化学结构改造的合成和半合成抗生素阶段。目前发现并分离到约9000种抗生素，半合成抗生素约1000种，共万种以上。但实际生产和应用的只有100余种。发酵制药种类①微生物菌体发酵微生物菌体发酵是以获得微生物菌体为目的，如：面包的酵母发酵、单细胞蛋白发酵（利用各种碳源）、真菌类（各种蘑菇、冬虫夏草）、生物防治剂（苏云金杆菌，伴孢晶体可以毒杀鳞翅目、双翅目害虫）。②微生物酶发酵微生物酶发酵是以获得酶为目的的发酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素时，制备中间体6－氨基青霉烷酸。③微生物代谢产物发酵初级代谢产物：氨基酸，核苷酸，维生素，有机酸。次级代谢产物：最主要的是抗生素。④微生物转化发酵利用微生物的一种或多种酶把一种化合物转变为结构相关的更有价值的产物的生化反应为转化发酵。制药微生物的种类生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。细菌主要生产环状或链状多肽类抗生素，如芽孢杆菌(Bacillus)产生杆菌肽（bacitracin），多黏芽孢杆菌（Bacilluspolymyxa）产生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。细菌还可以产生氨基酸和维生素，如黄色短杆菌（Brevibacteriumflarum）产生谷氨酸，大小菌生产维生素C。放线菌主要产生各类抗生素，以链霉菌属最多，诺卡菌属较少，还有小单孢菌属。生产的抗生素主要有氨基糖苷类（链霉素、新霉素、卡那霉素等）、四环类（四环素、金霉素、土霉素等）、放线菌素类（放线菌素D）大环内酯类（红霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大环内酯类（制霉菌素、抗滴虫霉素等）。酸性、碱性和中性，但以碱性为多。真菌的曲菌属产生桔霉素，青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等，头孢菌属产生头孢霉素等。脂环芳香类或简单的氧杂环类，多为酸性化合物。3发酵制药的基本过程菌种选育发酵工段提炼工段成品工段孢子制备种子制备发酵控制预处理分离提取浓缩纯化成品工段包装原料药实验室、种子库发酵车间提炼车间包装车间2.2微生物的生长特征微生物发酵基本过程特征（批式）菌体生长与产物生成的特征，三个阶段发酵前期(fermentationprophase)菌体生长期（cell发酵中期(fermentationmetaphase)产物合成（生产）期(productsynthesisphase)growthphase）发酵后期(fermentationanaphase)菌体自溶期(cellautolysisphase)发酵前期特征从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。pH变化：先升后降－先氨基酸作为碳源，释放出氨，而后氨被利用。先降后升－先用糖作为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，后又被利用。几个概念1延迟期延滞期（lagphase）或适应期是指接种后，菌体的生物量没有明显增加的一段时间。延迟期是菌体适应环境的过程。延迟期时间长短不一，与遗传和环境因素有关，由菌体与环境相互作用的程度决定的。因不同接种量、不同菌种和菌龄等而表现不同。工业上希望延迟期越短越好，常采用如种子罐与发酵罐培养基尽量接近，对数期的菌体作为种子、加大接种量等方法进行放大培养和发酵生产。2对数生长期对数生长期（logphase）是菌体快速繁殖，生物量的增加呈现对数速度增长的过程。特点是生长速率达到最大值，并保持不变。细胞的化学组成与生理学性质稳定。菌体生长不受限制，细胞分裂繁殖和代谢极其旺盛。可以认为细胞组分恒定，菌体细胞的生长速率与生物量是一级动力学关系3减速期减速期(declinephase)是指菌体生长速率下降的一段时间。由培养基中基质浓度下降，有害物质积累等不利因素引起。在减速期内，生长速率与菌体浓度仍符合一级动力学关系，但受基质浓度限制。一般生物的减速期较短。发酵中期特征以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段时间。菌体生长恒定就进入产物合成阶段呼吸强度：无明显变化，不增加菌体数目产物量：逐渐增加，生产速率加快，直至最大高峰，随后合成能力衰退。对外界变化敏感：容易影响代谢过程，从而影响整个发酵进程。发酵后期特征菌体衰老，细胞开始自溶的一段时间合成产物能力衰退，生产速率减慢。氨基氮含有增加，pH上升发酵必须结束，否则产物被破坏菌体自溶给过滤和提取等带来困难。自溶作用（autolysis）自溶作用是细胞的自我毁灭（cellularself-destruction），速溶酶体将酶释放出来将自身细胞降解。在正常情况下，溶酶体的膜是十分稳定的，不会对细胞自身造成伤害。如果细胞受到严重损伤，造成溶酶体破裂，那么细胞就会在溶酶体酶的作用下被降解，如某些红细胞常会有这种情况发生。在多细胞生物的发育过程中，自溶对于形态建成具有重要作用。生长与产物的关系模型从菌体生长、能源利用和产物生成速度的变化及其之间的动力学关系出发，Gaden把发酵过程分为三种模型。I型：菌体生长与产物生成偶联型(couplingmodel)。菌体的生长与产物生成直接关联，生长期与生产期是一致的。产物往往是初级代谢的直接产物，菌体生长、糖的分解代谢、能源利用和产物形成几乎平行，生长期与生产期是一致的，菌体生长期和产物形成不是分开的。细胞生长、基质消耗、能源利用和产物生成动力学曲线几乎平行，变化趋势同步，都有最大值，出现的时间接近。组成型表达的基因工程菌的产物生成属于此类型，蛋白质产物是细胞能量代谢的结果。乳酸、醋酸等初级分解代谢产物的生成也属于此类型。所以产物生成速率和比速率分别为：II型：菌体生长与产物生成半偶联型（semi-couplingmodel）。该模型介于偶联和非偶联模型之间，产物生成与基质消耗、能量利用之间存在间接关系。产物来自能量代谢所用的基质，但是在次级代谢与初级代谢分开的。在细胞生长期内，基本无产物生成，在生长的中后期生成大量的产物而进入产物形成期。分批发酵出现两个高峰，先是基质消耗和菌体生长的高峰，然后是产物形成的高峰。如柠檬酸和某些氨基酸的发酵，一部分组成型表达的蛋白质药物也属于此类型。产物生成速率和比速率分别为：；III型：菌体生长与产物生成非偶联型（non-couplingmodel）。菌体生长期与产物生成期为独立的两个阶段，先形成物质消耗和菌体生长高峰，几乎没有或很少有产物生成，然后进入菌体生长静止期，产物大量生成，并出现产物高峰。产物可能来自于中间代谢途径，而不是分解代谢过程，物质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢途径，初级代谢与产物形成是完全分开的，如抗生素、生物碱、微生物毒素的发酵。对于诱导型基因工程菌，往往在静止期，加入诱导物，基因转录和产物表达，所以产物生成速率和比速率分别为：代谢产物的生物合成代谢（metabolism）是生物体内进行的生理生化反应的统称。代谢分为分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)，前者是指把大分子降解为小分子的过程，为合成代谢提供能量和原料；而后者是指把小分子合成为复杂大分子的过程，满足细胞生长和分化的需要。初级代谢是营养物质转变为细胞结构物质和对细胞具有生理活性作用的物质，为细胞提供能量、合成中间体及其生物大分子的代谢网络。在初级代谢过程中形成的产物为初级代谢产物（primarymetabolite），包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。几乎所有生物的初级代谢基本相同。次级代谢存在于某些生物中，并在一定时期表达。次级代谢对正常的生长可能不必要，但对抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意义。次级代谢产物生物合成的基本特征（1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、环肽等键。（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色链霉菌既可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的多种次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的化合物。（3）生长期转向生产期，形态与生理发生变化。次级代谢产物是在细胞生长后期开始形成，当生长受限制时被启动。完成菌体营养生长期（trophophase）之后，出现次级代谢物合成期（idiophase），其生物合成比生长对环境更敏感，要求更高。次级代谢产物是以初级代谢产物为前体，受到初级代谢的调节。可能是缺乏某种营养成分，菌体生长抑制，启动了次级代谢物合成。菌体内中间代谢物积累，抑制了初级代谢酶，使之消失或活性下降，诱导了新酶的出现，转入生产期。芽孢杆菌形成芽孢，放线菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是细胞分化的伴随现象。（4）次级代谢产物是结构相似的一组混合物，但活性差异较大。参与反应的酶的底物特异性不强。产生菌利用一种或两种以上的初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，并继续对该产物进行修饰生成多种衍生物。一种次级代谢产物可由两种或两种以上代谢途径合成。（5）次级代谢产物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色体外，还有细胞质遗传物质，可能存在于质粒、线粒体基因。遗传物质的变异和丢失是导致菌种退化和生产不稳定的重要因素，所以具有代谢不稳定性。次级代谢产物的构建单位微生物合成的次级代谢产物是由微生物代谢产生的一些中间产物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初级代谢产物合成。把构成次级代谢产物的基本结构单位称为生源（biogen）。生源直接或间接来源于次级代谢过程的中间产物或初级代谢产物。构建单位包括聚酮体、甲羟戊酸、糖类、不常见的氨基酸（如D－氨基酸、β－氨基酸等）、环多醇和氨基环多醇等。次级代谢产物的生物合成的基本过程次级代谢产物的合成基本过程包括构建单位的聚合—再修饰—装配。在此过程中，次级代谢产物的累积受合成途径中某些酶活性的限制，这些关键酶活性大小与产量正相关。（1）前体聚合微生物合成生源后，通过缩合反应形成聚酮体、寡肽、聚乙烯等。各种聚酮体的合成过程相似，只是起始单位和延长单位不同。聚酮体是2－6个二碳单位的聚合反应的结果，酮基被保留，或只是还原为羟基。聚酮体可直接形成环，如四环素类和大环内酯类。进而被修饰，与相应基团如氨基糖、糖胺等结合，形成结构和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再与8个丙二酰单位缩合形成9酮化合物，再转化为中间体三环化合物。甲基化、还原、脱水、加氢、氧化形成4氧脱水四环素，加氯形成4氧脱水氯四环素，转氨形成4氨基脱水氯四环素