蛋白酶活性的测定

实验四蛋白酶活力的测定一、实验目的1、了解蛋白酶活力测定的原理；2、掌握蛋白酶活力测定的方法。二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；②0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）；③1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④5%三氯醋酸（TCA）溶液。四、实验步骤1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。3、在各试管中吸入2.00ml1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min（准确计时）后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。五、计算1、在规定的实验条件下，以每分钟增加0.001吸光度定义为一个酶单位。2、每克酶制剂中酶活力的计算：∆A×1000/(t×w)酶活力单位/克酶制剂式中，∆A——样品与空白吸光度差值（即A1和B1的吸光值）；t——酶作用时间（本实验为10min）；w——反应中酶的用量，g六、说明1、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的PH范围表现出活力，但是在接近中性条件下最有最高活力。2、微生物蛋白酶在45℃以下可保持较长时间的稳定性。七、思考题1、蛋白酶有哪几类？2、影响酶活力的因素有哪些？3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题？六、数据记录与处理A1=0.279B1=0.573酶含量为0.001g/ml酶活力1=∆A×1000/(t×w)=0.279×1000/10/0.001/0.20=1.395×105酶活力单位/克酶制剂酶活力2=∆A×1000/(t×w)=0.573×1000/10/0.001/0.40=1.4325×105酶活力单位/克酶制剂平均值=（1.395×105+1.4325×105）=141375酶活力单位/克酶制剂平均相对相差=（143250-139500）/141375×100%=2.65%七、思考题1、蛋白酶有哪几类？答：①按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C水解蛋白质或多肽的酯键；D水解蛋白质或多肽的酰胺键。②按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶③微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶④按蛋白酶作用的最适PH可以分为（A）PH2.5~5.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.5~10.5的碱性蛋白酶，（C）PH7~8的中性蛋白酶2、影响酶活力的因素有哪些？答：酶活力是酶催化某一化学反应的速率来表示的。酶活力的大小即酶含量的多少，可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示，酶活力的测定也就是测定酶促反应的速率。①酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，在一定范围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。②底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，酶促反应速度与底物浓度呈正比，即随底物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使再增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不会增加。③温度对酶活力的影响：在适宜的温度范围内，酶促反应速度随温度升高而增加，超过最适反应温度，酶活力将会下降。④PH对酶活力的影响：酶在最适PH范围内表现出活性，大于或小于最适PH，都会降低酶活性。⑤激活剂对酶活力的影响：某些无机阳离子、阴离子、有机化合物可作为激活剂，能够激活酶，使其表现出催化活性或强化其催化活性。⑥抑制剂对酶活力的影响：酶的抑制剂能够减弱、抑制甚至破坏酶的活力，它可降低酶促反应速度。3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题？答：①使用的比色皿必须洁净，并注意配对使用。手指应拿毛玻璃面的两侧，装盛样品量以2/3为度。透光面要用擦镜纸擦拭干净。②比色皿使用前应用试样润洗，使用后应立即用自来水冲洗干净，倒置晾干。③测定溶液的吸光度值应在0.1~0.7间最符合吸收定律，线性好，读数误差小。④吸光值在测定前应用空白溶液校正调零，再进行测定。