实验六-植物组织基因组DNA的提取与分析(CTAB法)

1实验六植物组织中DNA的提取与分析温馨提示：1、请将教室水浴锅打开，温度调至65℃。2、实验中-20℃冰浴时，请将样品放入6309室冰箱冷冻层。2（1）掌握植物组织中DNA提取的原理和方法。（2）掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测方法一、实验目的二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。CTAB,SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。二、实验原理再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。CTAB法流程图：植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤异丙醇沉淀DNA溶液6三、仪器和试剂1、仪器：恒温水浴锅、高速离心机、水平电泳槽、电泳仪。2、试剂：液氮、CTAB提取缓冲液、氯仿:异戊醇（24:1）、异丙醇、70%乙醇、TE缓冲液、上样缓冲液（0.5%溴酚蓝+40%蔗糖）、1×TAE电泳缓冲液。四、实验步骤称取0.1g植物幼苗加入适量液氮充分研磨，全部转入1.5ml离心管中加入0.5mlCTAB提取缓冲液，充分混合均匀65℃水浴10min，其间缓慢颠倒3次加入0.5ml氯仿:异戊醇，上下颠倒充分混匀12000r/min离心10min将上层水相移入另一新离心管加0.5ml预冷异丙醇，-20℃冰浴30min12000r/min离心10min弃上清，沉淀用0.5ml70%乙醇悬浮弃上清，加20μLTE溶解沉淀，即得DNA溶液12000r/min离心10min1、DNA的提取8四、实验步骤2、DNA电泳检测（1）1%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，加入30mL1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。（2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。9四、实验步骤2、DNA电泳检测（3）上样电泳：将20μLDNA样品溶液和5μL上样缓冲液混匀后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。（4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中10min左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。10五、实验结果与分析1234图1植物组织基因组DNA提取结果将凝胶图片打印出来，需要说明：1、小组点样孔号；2、DNA质量分析。六、注意事项（1）叶片磨得越细越好。（2）移液器的使用。（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步（研磨）的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。121、在DNA抽提过程中造成DNA分子断裂的主要因素有哪些？2、本实验中所用到下列试剂（CTAB、氯仿、异丙醇、75%乙醇）的作用各是什么?七、思考题