RT-PCR和real-time-PCR-原理及步骤

RT-PCR和real-timePCR原理及步骤PCR定义聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。多次循环后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。PCR原理10×扩增缓冲液4种dNTP混合物引物模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+加双或三蒸水逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增RT-PCR原理1.总RNA的提取。（试剂盒说明）RT-PCR基本步骤BufferdNTP混合物引物总RNA逆转录酶DEPC水（试剂盒说明）2.逆转录合成cDNA。3.PCR及跑胶。ddH2O10mMdNTP10×PCRbufferMgcl2上游引物下游引物模板cDNATaq酶Real-timePCR原理通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特异性探针Amplifluor(Intergen)荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。定量PCR的数学原理斜率与扩增效率标准品标准品梯度稀释方法1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲线分析SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA􀂉使用方便--不必设计复杂探针􀂉非常灵敏􀂉便宜Taqman的优点对目标序列有很高的特异性特别适合于SNP检测与MolecularBeacons相比设计相对简单Taqman的缺点价格较高只适合于一个特定的目标不能进行融解曲线分析分子信标的优点对目标序列有很高的特异性用于SNP检测的最灵敏的试剂之一荧光背景低分子信标的缺点设计困难无终点分析功能只能用于一个特定的目标价格较高其他荧光标记方法绝对定量与相对定量的定义绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究相对定量(RelativeQuantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物相对定量通过内标定量内标（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量相对定量分析方法1-ΔΔCt前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、计算表达水平比率：2–ΔΔCT=表达量的比值相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同待测样品目的基因浓度待测样品内参基因浓度F=对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度样品●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之间●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA纯度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1uL