嗜冷反硝化菌的筛选与固定及其利用固相碳源生物去除寒冷地区

嗜冷反硝化菌的筛选与固定及其利用固相碳源生物去除寒冷地区地下水中硝酸盐的研究（一）立项依据与研究内容1.项目的立项依据农业氮肥，畜禽排泄物的施用，城市生活污水，化粪池，工业含氮废水的不合理处置，使得硝酸盐己成为我国地下水尤其是浅层地下水最普遍的污染因子，其污染程度不断增加，尤其是我国北方农村地区。这对人体健康造成了极大威胁。传统异养生物反硝化仍是最具吸引力的处理方法。但较物理化学处理技术相比,此过程反应速度慢，主要受反硝化菌生物量与活性、有机碳源的类型与浓度、环境条件等因素的影响。这也是近年来众多学者对地下水中硝酸盐生物去除研究的焦点所在。可以想象，直接用反硝化微生物处理地下水，生物量和水力保留时间必然受到限制。众多研究采用包埋固定化细胞技术解决这一问题，可维持较高的生物量，同时发现包埋后的微生物在不适环境中，仍然可以保持较高的活性，而未包埋的微生物的活性被大大降低[1]、[2]、[3]。相对于溶解性有机碳（DOC），环境中的易氧化的固相有机碳（SOC）也可被反硝化菌利用进行反硝化。由于在脱氮过程中不需要额外加可溶性有机物为反硝化菌群的生长繁殖补充营养物质，并具有缓效释放碳源的特点，以固相碳源为电子供体的异养生物反硝化研究成为又一热点。碳源的种类、环境条件对固相碳源反硝化的影响都做了较深入的探讨[4]。尽管如此，不能忽略的是环境条件对利用固相碳源异养反硝化的影响，尤其是温度的影响。尤其在东北寒冷地区，地下水水温偏低，常年维持在10-15℃，必将会对反硝化效果产生较大的影响。对微生物来讲，反硝化细菌大多属于中温型细菌，适宜温度是20-40℃,低于15℃时,反硝化菌的增殖速率降低,代谢速率也降低,从而降低了反硝化速率。尽管包埋反硝化菌比未包埋菌对低温有较强的抵抗能力，但在低温下包埋菌活性必然也会大幅下降。有研究表明11℃低温下聚乙烯醇包埋反硝化菌活性与30℃下降了约58%[5]。对于固相有机碳源来讲，低温导致碳源释放变慢，地下水中的DOC浓度较低,反硝化能力较弱，停留时间较长。对于麦秆、棉花、废报纸、可降解餐盒等固相碳源反硝化，在30℃以下,随温度的降低,反硝化速率也随之降低.Volokita[6]、金赞芳[7]等用报纸、棉花等作为饮用水生物反硝化的碳源和生物膜载体,分别发现32℃下的反硝化速率大约是14℃下的3倍，25℃下的反硝化速率大约是14℃下的2倍。在10-15℃范围内,温度对反硝化率的影响比常温时要大[8]。那么在生物处理寒冷地区低温地下水时如何能提高反硝化速率呢？一方面低温时反硝化菌的增殖与代谢速率不应该降低；另一方面，低温时碳源的释放速率不应该降低。有没有一种嗜冷反硝化菌株？有没有一种固体碳源在低温时的释放速率相比其他碳源更保持稳定？找到这样一种菌株及固体碳源，问题就迎刃而解了。实际上，耐冷或嗜冷菌的筛选及应用于低温生活污水处理、反硝化除磷近年已见研究[9]、[10]，并取得了良好效果。而嗜冷反硝化菌的筛选及应用研究极少。低温固相反硝化固体碳源缓释速率与选择的研究更鲜见报道。综上所述，本研究提出利用固相碳源的包埋嗜冷反硝化菌生物反硝化去除寒冷地区低温地下水中的硝酸盐。通过对嗜冷反硝化菌的筛选、包埋固定以及固相碳源缓释速率及动力学的研究，选择固相碳源，探讨嗜冷菌生物反硝化处理低温地下水硝酸盐的效果及影响、反应机制。通过对本项目研究，可深化生物反硝化作用机理，同时为北方寒冷地区低温地下水中的硝酸盐稳定、高效处理提供新思路、新工艺，有一定的理论及应用价值。参考文献[1]李正魁,濮培民.辐射聚合固定化反硝化菌去除污水中硝酸盐.江苏农业学报，2000,16(1):37-40[2]谭佑铭,罗启芳.固定化反硝化菌去除水中硝酸盐氮的研究.环境与健康杂志，2001,18(6):371-373[3]傅利剑.反硝化微生物生物学特性及其固定化细胞对硝态氮去除的研究.南京大学博士学位论文,2004.[4]刘江霞,罗泽娇,靳孟贵等.利用固态有机碳源的地下水生物反硝化及影响因素研究进展.安徽农业科学,2008,36(4):1585-1588[5]袁林江.聚乙烯醇固定化反硝化菌的脱氮试验研究.西安建筑科技大学学报,1997,29(3):257-261[6]VolokitaM,BelkinS,AbeliovichA,SoaresMIM.Biologicaldenitrificationofdrinkingwaterusingnewspaper.WaterRes,1996,30:965-971[7]金赞芳,陈英旭,小仓纪雄.以棉花为碳源去除地下水硝酸盐的研究.农业环境科学学报,2004,23:512-515[8]范振兴,王建龙.低温对固体碳源填充床反硝化的影响.清华大学学报(自然科学版),2008,48(3):436-439[9]贲岳,陈忠林,徐贞贞等.聚氨酯固定高效优势耐冷菌处理低温生活污水.哈尔滨工业大学学报,2009,41(2):76-80[10]王春丽,马放,王强.一株耐低温反硝化聚磷菌的筛选及其特性研究.环境工程学报,2007,1(4):21-242.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题2.1研究内容（1）嗜冷反硝化菌的筛选及其特性研究A菌株的筛选从实验室运行稳定的反硝化反应器中取富含反硝化的活性污泥,经硝酸盐还原产气及降温（30℃-25℃-20℃-15℃-10℃）两次筛选，筛选出在低温下仍具有较高活性的反硝化菌株。B菌株的鉴定C菌株的特性研究菌株在0℃生长情况；菌株的生长速率；菌株硝酸盐降解能力（2）嗜冷反硝化菌的包埋固定A菌株的包埋菌株包埋方法的确定B包埋嗜冷菌生物活性测定（3）低温条件下地下水生物反硝化固相有机碳源的选择选择三种固体碳源：麦秆、棉花及PCLA低温条件下不同固相碳源静态缓释速率比较B不同固相碳源的嗜冷反硝化菌硝酸盐降解动力学机制研究不同碳源的硝酸盐降解过程，同时进行动力学模拟与分析。（4）利用固相碳源嗜冷反硝化菌去除地下水硝酸盐工艺与机制研究A工艺影响因素研究主要考察：温度、溶解氧、水力停留时间、pH值、C/NB工艺反应机理研究从动力学及微生物学角度探讨分析低温下嗜冷反硝化菌利用固相碳源的反硝化机制2.2研究目标（1）阐明利用固相碳源的包埋嗜冷反硝化菌生物反硝化去除寒冷地区低温地下水中的硝酸盐的宏观影响机制（2）揭示利用固相碳源的包埋嗜冷反硝化菌生物反硝化动力学机制（3）研发低温地下水硝酸盐去除新工艺2.3拟解决的关键科学问题（1）低温对反硝化菌活性的不利影响拟解决方案：筛选在低温（10-15℃）下仍具有较高活性的嗜冷反硝化菌，同时进行包埋，两种手段确保了低温下反硝化菌的活性与生物量。（2）农村废弃农作物的综合利用技术拟解决方案：利用农村废弃农作物麦秆、棉花等固体碳源生物反硝化去除地下水中硝酸盐，为农村废弃农作物找到出路，解决焚烧等处理手段带来的污染问题。3.拟采取的研究方案及可行性分析3.1研究方法与实验手段嗜冷反硝化菌的筛选从实验室运行稳定的反硝化反应器中,取富含反硝化的活性污泥做为实验样品。取10mL污泥至装有90mL无菌水三角瓶中,加入玻璃珠,将三角瓶放入空气振荡器中,把污泥充分摇匀打碎。打碎后的污泥经倍比稀释,在牛肉膏蛋白胨培养基上采用混均平板法和涂布平板法分离、纯化。之后进行硝酸盐还原产气试验对菌株进行初筛。然后通过设置温度梯度的方法对各菌株降温驯化培养进行复筛，进而得到嗜冷反硝化菌株。菌株的鉴定形态学、革兰氏染色结合16S-rDNA序列同源分析菌株特性研究菌种在0℃生长情况的测定—将培养2-3d的待测菌液取0.1mL接入装有10mL培养基的试管中,置于低温培养箱内,在0℃条件下进行培养,在第5、10和15d时观察菌株生长情况。生长速率的测定—10℃条件下采用光电比浊法测定其生长速率,并推算出世代时间。硝酸盐降解能力测试—在pH值7.0-7.2、温度10℃条件下分别测定菌株对水中硝酸盐的去除效果。实验用水主要以葡萄糖加氮、磷配制,使BOD5∶N∶P约为20∶5∶1,使原水硝态氮约50mg/L。菌株的包埋将筛选出的嗜冷菌制成质量浓度为8%～10%的嗜冷菌悬浮液，并将得到的嗜冷菌悬浮液与质量浓度为8%～10%、海藻酸钠含量为0.016g/L的聚乙烯醇水溶液在温度为20℃～25℃的条件下按照1∶1的体积比混合，然后将混合后的溶液与聚氨酯泡沫填料按照1∶3的体积比混合，静置1至2h得到包埋嗜冷菌的聚氨酯泡沫载体，再将包埋嗜冷菌的聚氨酯泡沫载体放入CaCl2含量为0.016g/L、pH值为6.7的饱和硼酸溶液中浸泡，在24h内每间隔7至9h搅拌一次，最后用生理食盐水冲洗三次和自来水冲洗三次即得包埋固定化嗜冷菌。包埋嗜冷菌生物活性测定测定制备的包埋嗜冷反硝化菌在低温低溶解氧条件下脱氮效率。固相碳源缓释速率的测定固相碳源经过初期释放后，更换水溶液，注入新鲜去离子水，用检测COD的变化情况考察不同碳源持续缓释放有机质的能速度。利用不同固相碳源嗜冷反硝化菌硝酸盐降解动力学机制对不同碳源时的硝酸盐降解过程进行动力学模拟与分析。3.2技术路线3.3关键技术（1）固相碳源反硝化出水BOD控制拟解决方案：与固体碳源种类与投量（纤维素类固相碳源更易降解，致使溶液中COD高）、水力停留时间、固相有机碳源静态缓释速率、嗜冷反硝化菌反硝化速率、原水硝酸盐浓度等有关，必须控制好操作条件，尤其是碳源的投加量，防止出水BOD超标。（2）利用固相碳源嗜冷反硝化菌反硝化中间产物积累的控制拟解决方案：A不同碳源种类的影响，也作为碳源选择的考察指标。B控制溶解氧及pH值。3.4可行性分析申请者一直在从事脱氮除磷研究，理论基础扎实。攻读博士期间，参加国家自然科学基金项目2项，在包埋菌的UV光制备及其对微污染水的处理研究（50708058)中，熟练掌握包埋方法，为本项目的包埋反硝化菌制备奠定了技术基础；在以零价铁为电子供体实现生物自养反硝化及同步除磷的研究（20677040)中，熟练掌握菌种的分离鉴定方法，成功筛选并鉴定了以零价铁为电子供体的自养反硝化微生物，为本项目嗜冷反硝化菌的分离与鉴定提供了技术保障。申请者参加工作以来，也一直围绕废水脱氮、地下水硝酸盐污染修复、生物反硝化应用的拓展展开研究，获批省基金等项目多项，本项目的顺利实施打下良好的基础。（详见“承担项目”）申请者对本项目已有一些工作基础，取得了一些有益的成果。（详见“工作基础”）本实验室具有完备、先进的实验仪器和设备（详见“工作条件”）课题组人员配备合理、年轻富有活力。以上均为本申请项目的开展以及预定目标的实现打下了坚实的基础。4.本项目的特色与创新之处（1）特色提出利用固相碳源的包埋嗜冷反硝化菌生物反硝化去除寒冷地区低温地下水中的硝酸盐。通过对嗜冷反硝化菌的筛选、包埋固定以及固相碳源缓释速率及降解动力学的研究，选择固相碳源，探讨嗜冷菌生物反硝化处理低温地下水硝酸盐的效果及影响、反应机制。（2）创新提出了新思想—生物反硝化去除硝酸盐可克服低温的不利影响提出了新内容—利用固相碳源的包埋嗜冷反硝化菌生物反硝化提出了新方法—固相碳源缓释速率作为评价固相碳源的指标之一5.年度研究计划及预期研究结果（1）年度研究计划2011.01～2011.02试验前期准备工作2011.03～2011.07嗜冷反硝化菌的筛选2011.08～2011.12包埋嗜冷反硝化菌的制备2012.01～2012.04不同固相碳源缓释速率研究2012.05～2012.12不同固相碳源嗜冷反硝化菌硝酸盐降解动力学研究2013.01～2013.09利用固相碳源嗜冷反硝化菌生物去除低温地下水中硝酸盐工艺与机制研究2013.10～2013.12项目总结及结题报告的撰写（2）预期研究结果A确定利用固相碳源嗜冷反硝化菌生物去除低温地下水中硝酸盐工艺影响机制，在10-15℃低温条件下使硝酸盐去除率达到80%以上，无中间产物生成，出水BOD达标。B找到最合适的固相碳源，缓释能力强，无二次污染。C初步揭示低温下嗜冷反硝化菌利用固相碳源生物去除硝酸盐的微观机制。D研究成果以论文形式发表在国内核心期刊或国际刊物上（预计完成论文3