2.10--基因工程制药-基因工程药物的分离纯化

呼伦贝尔学院高明华基因工程制药基因工程药物的分离纯化第十节基因工程药物的分离纯化基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质。具有以下特点：①表达产物在初始料中含量较低；②含有大量细胞及代谢产物；③表达产物稳定性差，易失活变性；④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；⑤应用面广，对其质量要求纯度高、无菌、无热原。1、含目的产物的起始料的特点基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：①菌种的类型及其代谢特性；②原材料培养基的来源及其质量；③生产工艺及条件；④初始物料的物理、化学和生物学性质。一、建立分离纯化工艺的根据2、物料中杂质的种类和性质包括：相关性和非相关性杂质的含量、化学性质、结构、相对分子量、电荷分布、稳定性、溶解度等。3、目的产物特性包括：理化生性质，如结构、相对分子量、等电点、电荷分布、密度、溶解度、稳定性、疏水性、亲和性、配基等。4、产品质量的要求产品质量标准、用途、纯度、生物活性等二、分离纯化的基本过程由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品分离纯化的技术要求①技术条件温和能保持产物生物活性；②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数；③收率要高；④两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理；⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。三、细胞的破碎方法细胞破碎（cellrupture）是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解细胞壁的组成和结构。细胞壁的组成与结构革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母霉菌植物细胞壁厚(nm)20~8010~13100~300100~2502~7μm层次单层多层多层多层多层主要组成肽聚糖多糖磷壁酸蛋白质脂多糖肽聚糖脂蛋白脂多糖磷脂蛋白质葡聚糖甘露聚糖蛋白质脂类多聚糖脂类蛋白质纤维素半纤维素果胶物质木质素蛋白质破碎难易程度较难破碎较易破碎较难破碎难破碎很难破碎细胞破碎技术的分类分类破碎原理破碎技术举例物理破碎法固体剪切作用珠磨法、x-press法液体剪切作用高压匀浆、超声破碎化学破碎法溶胞作用渗透冲击、增溶法膜失水作用脂溶法生物破碎法破坏细胞壁酶溶法自身酶的溶解自溶方法技术原理效果成本举例物理破碎法匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎适中适中动物组织及动物细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞的物理破碎法方法技术原理效果成本举例化学破碎法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵增溶法表面活性剂溶解细胞壁温和适中胆盐作用于大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁融解剧烈便宜细胞的化学破碎法四、固液分离1、离心沉淀高速离心和超速离心；2、膜过滤微滤、超滤和反渗透；3、双水相萃取聚乙二醇-无机盐法；五、目的产物的分离纯化目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。产物特性作用等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间产物的主要特性及在分离纯化中的作用基因工程药物生产中常用的分离纯化方法方法目的离心/过滤去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质阴离子交换层析去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒40nm微孔滤膜过滤进一步去除病毒阳离子交换层析去除牛血清蛋白或转铁蛋白等超滤去除沉淀物及病毒疏水层析去除残余的杂蛋白凝胶过滤与多聚体分离0.22μm微孔滤膜过滤除菌（一）离子交换层析（ionexchangechromatographyIEC）离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。离子交换剂的组成结构及其特性基质电荷基团反离子商品名纤维素—O—CH2——COO-·Na+CM-纤维素纤维素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2·Cl-DEAE-纤维素聚苯乙烯—————SO3-·Na+732阳离子树脂聚苯乙烯——N+（CH2）4·Cl-717阴离子树脂仪器设备简介离子交换全套装置三、离子交换柱层析原理示意图（二）疏水层析（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）疏水色谱主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。流动相为pH6～8盐水溶液。在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性小。（三）亲和层析（affinitychromatography，AC）亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。亲和层析大体可分三步：①配基固定化②吸附目的物③样品解吸（四）凝胶过滤凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。主要应用两个方面：①脱盐和更换缓冲液②蛋白质分子的分级分离。六、非蛋白质杂质的去除1、DNA的去除DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。非蛋白质杂质的去除2、热原质的去除热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。3、病毒的去除层析或过滤可将病毒去除。七、选择分离纯化方法的依据1、根据产物表达形式来选择分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式，它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化.为了获得周质蛋白经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段，即通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。2、根据分离单元之间的衔接选择随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。3、根据分离纯化工艺的要求来选择分离纯化工艺应遵循以下原则：⑴具有良好的稳定性和重复性；⑵尽可能减少组成工艺的步骤；⑶各技术步骤间要相互适应和协调；⑷工艺过程中尽可能少用试剂；⑸工艺所用时间要短；⑹工艺和技术必须高效，收率高、易操作、能耗低；⑺具有较高的安全性。小结