TrkB受体再循环的研究进展

受体再循环的研究进展#王珏，黄淑红**基金项目：高等学校博士学科点专项科学基金（新教师基金）（200804221070）作者简介：王珏(1986-)，女，硕士研究生，神经生物学通信联系人：黄淑红（1978-），女，副教授，主要研究方向：神经生物学.E-mail:[e-mail]（山东大学医学院神经生物学研究所）5摘要：受体酪氨酸激酶B（TrkB）的内吞途径与其活性密切相关。配体介导的受体内吞后有降解和再循环两种途径，这两种分选方式对于细胞信号传递的延长和可持续产生截然相反的作用。本文主要介绍了受体内吞后分选途径的分子机制和生物学功能的研究进展。关键词：神经生物学；内吞；再循环；分选中图分类号：Q29110ProgressonTrkBreceptorrecyclingresearchWANGJue,HUANGShu-Hong(DepartmentofNeurobiologySchoolofMedicine,ShandongUniversity,Jinan250012)Abstract:TheendocyticpathwaytightlycontrolstheactivityoftyrosinekinasereceptorB(TrkB).15Ligand-inducedendocytosiscandrivereceptorsintodivergentlysosomalandrecyclingpathways,producingessentiallyoppositeeffectsonthestrengthanddurationofcellularsignaling.Thisarticlereviewsrecentfindingsthatthemolecularmachineryandfunctionalimplicationsofreceptorsortingintheendocyticpathway,inadditiontopromotingtwokindsofrecycling.Keywords:neurobiology;endocytosis;recycling;sorting200引言细胞内吞是细胞从周围环境中摄取各种物质的过程,也是细胞生理代谢的一个极为重要的现象。几乎所有的真核细胞都可以通过内吞作用摄取细胞外基质中的大分子。70年代中期,Steinman等人首先发现了细胞膜系统再循环现象,后来受体再循环的研究也越来越受25到关注。神经营养素属于分泌蛋白家族一员，包括神经生长因子（NGF），脑源性神经营养因子（BDNF），神经营养素-3（NT-3）和NT-4/5。这些蛋白通过与各自的受体结合发挥生物学功能。每一种神经营养素可通过结合两种不同类型的细胞表面受体—Trk受体酪氨酸激酶和p75神经营养素受体,介导胞内复杂的信号通路：NGF与TrkA受体特异性的结合；BDNF30和NT-4/5结合TrkB受体；NT-3结合TrkC受体[1,2,3]。BDNF是神经营养因子家族中的一员，它是一种重要的神经营养蛋白，可以调节神经元的存活和分化[4]。目前，越来越多的证据表明BDNF在调节神经元的活性和突触可塑性方面也发挥着重要作用[5,6,7]。BDNF以活性依赖性的方式释放调节神经元的神经递质和突触传递。BDNF的信号转导和神经营养功能主要通过TrkB受体来调节，TrkB受体为BDNF的高亲和35力酪氨酸激酶受体。二聚体形式的BDNF激活细胞表面的TrkB受体，进而起始细胞内的信号传递链，引起不同的生物学反应。对于大部分生长因子来说，受体的内吞会终止生长因子的信号传递链[8]。但是，激活的Trk受体酪氨酸激酶内吞之后，可对神经营养因子生物学功能产生重要影响[9,10]，而目前对Trk受体再循环的研究还不是很多。所以本文通过受体内吞之后不同分选途径的探讨，阐述目前对受体再循环研究的方法及意义，希望对今后研究调控40受体再循环调控机制有所帮助。1受体内吞后的命运几乎所有受体介导内吞的过程在初期都是相同的,都于有被小窝处下陷,形成有被小泡进入细胞。随后网格蛋白迅速解聚,形成光滑小泡。光滑小泡相互溶合,或和早期内体融合。接下来,内吞后不同受体和配体的命运开始有了不同。根据目前的文献可知,受体在内吞后45的命运主要有以下两种方式。1.1内体-溶酶体分选途径受体由早期内体向降解途径的分选依赖于分选信号的存在。包括表皮生长因子（EGFR）在内的许多信号受体在转运到溶酶体的途中，都含有一个对分选结构的募集反应所必须的细胞结构域。而在受体酪氨酸激酶的结构中，赖氨酸残基的单泛素化或多泛素化对于其向降解50途径的分选有着重要作用[11，12]。目前关于内吞后分选机制的一研究主要是关于酵母中蛋白是怎样转运到空泡，这种空泡是一种用于水解蛋白的结构，类似于哺乳动物的溶酶体[13]。许多空泡蛋白分选所必须的基因已经被找到（thevacuolarproteinsortinggenes，VPSgenes)。通过精确的遗传和生化实验方法找到了一组基因——theclassEVPSgenes，这组基因编码的一段保守的内体相关蛋白可55以指引生物合成的和内吞的膜蛋白分选到空泡。这些蛋白主要以三种复合物的形式存在于细胞质中和内体膜上，分别叫做转运必需的内体分选复合物（endosomalsortingcomplexrequiredfortransport，ESCRT）-Ⅰ，ESCRT-Ⅱ，ESCRT-Ⅲ。在包括哺乳动物在内的真核生物中，这种分选机制是非常保守的，它在细胞相关元件的结构和生化功能中有着关键性的作用[14-17]。60简而言之，ESCRT假说解释了泛素化的货物是怎样通过内吞中间体，又名多囊泡体（multivesicularbody，MVB），定向运输到空泡。首先这一分选过程起始于结合在早期内体膜上的一种特殊的蛋白复合物（并未被正式地认为是ESCRT的一种，但经常被叫做ESCRT-0），这种蛋白复合物含有肝细胞生长因子调控的酪氨酸激酶亚基（hepatocyte–growthfactor–regulatedtyrosinekinasesubstrate，Hrs）。Hrs含有一个可以与泛素化的膜蛋白相结65合的泛素结合基序（ubiquitin-interactingmotif，UIM），Hrs通过UIM域和蛋白Tsg101介导货物向ESCRT结构转运，其中蛋白Tsg101是与Hrs直接结合的ESCRT-Ⅰ的核心构件。Hrs与Tsg101的亚基结合然后被运送到ESCRT-Ⅰ，从而到达晚期内体膜上。接下来ESCRT-Ⅱ复合物结合到ESCRT-Ⅰ上，然后是ESCRT-Ⅲ的募集，最终导致膜的凹陷及MVBs的形成。在管内膜结构的继续形成和递送膜上的货物等方面，需要ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ蛋白70复合物，而且这也与膜外成熟的多囊泡体相关。这种分选方式被认为可以防止受体再循环并将受体“交付”到溶酶体。[14-17]。1.2内体-细胞质膜表面再循环分选途径除了被运送到溶酶体降解外，受体内吞到早期内体后还可以通过再循环途径回到细胞膜表面。早期内体膜上大量的成管现象促使受体向再循环途径分选。除此之外，细胞内吞再循75环小泡处的Rab11蛋白与受体结合可介导一种回到质膜的“慢速再循环”途径[18,19]。然而，Rab4还可以介导受体以“快速再循环”途径分选回膜上[20,21]。其中的经典代表就是转铁蛋白受体（Transferrinreceptor，TfR），它位于哺乳动物细胞膜表面，能与携带有两个Fe3+的Tf结合形成(Fe3+)2-Tf-TfR复合体,该复合体通过内化作用进入胞内的早期分选内体。内体的与Tf的结合力下降,Fe3+被释放到细胞中;Tf-TfR复合体则进入再循环内80体,并通过再循环途径返回质膜,空载的Tf与TfR解离,释放回血液准备再次获取Fe3+。由于其大量的存在，TfR也成为了再循环囊泡的标志。动力学研究表明，TfR同时存在快速（5min）和慢速（15-30min）两种再循环途径[22]。2再循环的机制细胞膜受体内吞后通过再循环途径重新回到细胞膜上行使功能，可缓解由于受体大量内85吞造成的细胞脱敏。目前关于细胞膜受体内吞后再循环的研究多集中在G蛋白偶联受体（GPCR）。研究认为GPCR的再循环存在“默认再循环（defaultrecycling）”和“序列调控再循环（Sequence-directedrecycling）”两种方式。在许多GPCR中发现了参与调控再循环的短序列，这些序列与一些胞内蛋白分子例如Hrs等共同调控GPCR受体的再循环。最近我们的研究也表明，在TrkB受体中，也同样存在默认的再循环和序列调控的再循环。902.1“默认再循环”许多膜蛋白的胞质区由于缺失调控序列，所以采用“默认再循环”的方式回到膜表面。人们通过对β2肾上腺素受体（β2ADR）的研究发现，缺失EKENKLL序列的β2ADR，内吞后不会分选到PDZ/Hrs依赖的再循环途径中，而通过一种“默认”的再循环方式回到膜表面[23]。TrkB.T1是由于剪接方式不同而产生的截短型TrkB受体，它的胞内域没有激酶95区。我们研究表明，TrkB.T1的再循环过程也是一个“默认再循环”，即它在内吞之后会快速的回到质膜表面[24]。2.2“序列调控再循环”对于很多GPCRs来说，配体诱导内吞后的再循环依赖于其特异的细胞质序列（表1），这种再循环方式又被称为“序列调控再循环”。许多GPCRs的胞质区包含一段特异的序列，100从而产生配体诱导内吞后的高效再循环。这些受体的再循环序列都可以与含PDZ（postsynapticdensity95/disclarge/zonulaoccludens-1）域的蛋白相结合。例如β1肾上腺素受体、β2ADR和促甲状腺激素受体均含有一段再循环序列，这些序列的远端可与含有PDZ域的蛋白相结合。表1GPCR胞质区再循环序列及相互作用蛋白的总结105Tab.1SummaryofrecyclingsequencesandinteractingpartnersidentifiedinGPCRcytoplasmictailsReceptorGPCRrecyclingsequence(aminoacidnumber)Protein(s)thatinteractwithrecyclingsequenceReferencesβ1-adrenergicS(312)andESKV(474–477)PSD-95,SAP97;GIPC,CAL,MAGI-2;MAGI-3[25-29]β2-adrenergicDSLL(410–413)NHERF-1,NHERF-2,PDZK1,NSF[30]Thyrotropin-stimulatinghormone(TSH)TVL(762–764)hScrib[31]3受体再循环的研究方法研究受体再循环的方法有很多,随着越来越多的学者对受体再循环问题的重视,新的方法也不断地被发明和引进。总的来说,从研究手段上可分为两大类,形态学方法和生物化学110及分子生物学方法。法生化方法通常是通过分析膜泡成分研究内吞的过程。如将细胞匀浆后通过梯度离心等不同方法,能够分离出和内吞有关的膜泡成分并进行分析测定。可裂解生物素法是用可裂解生物素对细胞膜表面的蛋白进行标记，再研究其再循环的实验方法。简介如下：115在用磺基-NHS-S-S-生物素对细胞进行生物素标记之前，先将其在100μg/ml亮抑蛋白酶肽中预孵育90min。在接下来的所有步骤中均要含有亮抑蛋白酶肽，以此来抑制溶酶体的蛋白水解。在磺基-N