PI单染细胞周期检测-protocol(mo--new)

PI单染检测细胞周期操作步骤：1、铺板：5×105cells/ml，六孔板，每孔1ml。2、血清饥饿法进行细胞同步化处理：无血清培养基培养8-12h，然后才加药。注意：实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其他阶段细胞增多。3、收集细胞悬浮细胞：直接离心收集细胞，弃上清，在4℃、1200rpm用预冷的PBS洗细胞2次；贴壁细胞：a.将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞）b.PBS冲洗液c.不含EDTA的0.25%的胰酶消化1-5min后，将细胞吹打成单细胞悬液将a、b、c合并后1200rpm离心5min；弃上清；用PBS清洗一次，再次弃上清，加入1.5mlPBS重悬细胞；注：为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，可选用多孔培养板；在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。4、固定：将细胞悬液加入预冷（-20℃）无水乙醇3.5ml，使乙醇终浓度为70%，4℃固定过夜。注意：（1）加入无水乙醇的时候要逐滴、慢速；（2）不是向细胞中加70%乙醇，而是向细胞悬液中加无水乙醇，这样是为了减少细胞聚集；（3）在染色之前细胞4℃固定可保存3周；5、离心收集细胞：以预冷（4℃）PBS洗细胞一次，调整细胞浓度≧1.0×106；6、PI综合染液：弃上清，在106细胞中加入0.5ml综合染液，重悬细胞后37℃水浴30min。PI综合染液配方（prepare11mlstainingsolution）成分浓度用量补加PBS至11ml终浓度（必须保证）PIstockingsolution1mg/ml550μl9240μl50μg/mLRNaseAstockingsolution10mg/ml110μl100μg/mlTritonX-1002%1100μl0.2%PIstockingsolution:5mgPI+5mlPBS--------混匀于15ml避光离心管RNaseAstockingsolution:10mg+1mlPBS--------混匀于1.5ml避光离心管TritonX-100:0.5ml+25mlPBS--------混匀于50ml避光离心管注：（1）RNaseA于－20℃保存，其它4℃保存并避光；（2）Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核，提前两小时配，难溶；（3）在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI易透过细胞膜和核酸结合，为避免干扰染色前需用RNAseA降解RNA。这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量；PI染剂最佳工作温度为4℃，低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。7、300目尼龙网过滤后上机；8、每组取20000个细胞，流式细胞仪进行细胞周期DNA含量分析，PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。分别计算细胞周期各时相细胞数的百分比和DNA含量比。实验重复三次。注意：（1）一般检测用低速流，误差小。（2）留三个图（散点图FSC-A/SSC-A、直方图FL2-A/count、散点图FL2-H/FL2-A）（横坐标/纵坐标）9、细胞周期分析：(用ModFitLTV3.0软件分析结果)正常人静止体细胞有46条染色体，为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期的各个时期（G0、G1、S、G2、M）中DNA含量随各时相呈现出周期性变化，在G1期细胞开始合成RNA和蛋白质，但DNA含量仍保持二倍体，进入S期后开始合成DNA，此时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间。当DNA复制成4倍体时细胞进入G2期并继续合成RNA和蛋白质，直到进入M期，因此单纯从DNA含量无法区分G2期和M期，一旦有丝分裂分裂成2个细胞，同样G0和G1期的DNA含量也无法区分。PI荧光染料与DNA结合，其结合量与DNA含量成正比。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期。G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。如何看这个图：横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数量。在每个图的旁边都会配有一些这个图的相关说明，如此图中我们看到DipG1:57.46%at48.73，表示G1/0期的细胞占总细胞的57.46，荧光强度在48.73；DipG2:10.49%at94.96同理表示：G2/M0期的细胞占总细胞的10.49%，荧光强度在94.96；大家可以算一下，二者之间荧光强度的比94.96/48.73应该是约等于2的，这就是说G2/M期DNA含量为G1/0期的2倍，又验证了理论的推断。同样S期所占百分比也会体现出来。在肿瘤病理学中，通常以S期细胞数量来判断肿瘤增殖状态。细胞增殖指数是指S期和G2/M期细胞之和占总细胞数的百分比，它反映细胞的增殖能力。9、凋亡的结果判定在FSC/SSC散点图上显示凋亡细胞比正常细胞小（FSC小），在PI荧光图上，G0/G1期峰前出现亚二倍体峰。从这个图，我们可以看到在G0/G1期峰前出现了亚二倍体峰（绿色），右边有各项参数，其意义上文我已讲述过，大家可以仔细看一下，上文没讲过的地方，相信大家一看就明白了。比如在右侧最后一行，写了Apoptosis:36.76%Mean:34.12,就指的是凋亡细胞占36.76%，其荧光强度在34.12。