代谢组学：基于质谱的研究方法

代谢组学技术和软件的挑战与发展代谢组学：基于质谱的研究方法基础导论2代谢组学引言..........................................................................................................................................................................................3什么是代谢组学？代谢组学“Metabolomics”与“Metabonomics”代谢组学的一般研究流程质谱在代谢组学中的应用代谢组学中所用的分离技术代谢组学的挑战选择GC/MS或LC/MS研究代谢组学的原因.....................................................................................................................................5发现代谢组学..........................................................................................................................................................................................7代谢谱分析，寻找有统计学意义的代谢物安捷伦GC/MS在发现代谢组学中的应用LC/MS在发现代谢组学中的应用靶向代谢组学........................................................................................................................................................................................13靶向代谢组学概述GC/MS在靶向代谢组学中的应用LC/MS在靶向代谢组学中的应用代谢组学分析软件.................................................................................................................................................................................16化合物鉴定............................................................................................................................................................................................18安捷伦METLIN个人代谢物数据库在METLIN个人代谢物数据库中添加保留时间，改善化合物鉴定安捷伦FiehnGC/MS代谢组学RTL数据库采用GC/MS和安捷伦AgilentFiehnGC/MS代谢组学RTL数据库鉴定血浆中的代谢物应用实例...............................................................................................................................................................................................22水稻白叶枯病的代谢谱分析最大限度地提高综合代谢组学研究中红细胞的代谢物提取效率引文.......................................................................................................................................................................................................24目录3什么是代谢组学？代谢组学是通过比较对照组和实验组的代谢组（metabolomes，某一生物的所有代谢物组分），以寻找其它代谢谱差异的研究方法。这些差异可能与临床生物标志物发现中研究的某些疾病相关，也可能与药物研发毒理研究中候选药物摄入后的代谢改变有关。环境代谢组学在研究化学品接触对野生生物和环境的影响方面日益受到重视。在农业/化工领域，代谢组学可用于除草剂和杀虫剂的开发。随着食品健康和食品安全重要性的提高，代谢组学将可能成为监测和改善食品质量的有用工具，可用于食品加工和质量控制，或改良作物品种和开发新食品的作物育种等领域。随着能源需求的不断增长及天然能源的日益耗竭，人们一直在寻找新的替代能源，如植物或微藻类生物能。用代谢组学可以研究这些生物体在不同环境和遗传条件下的代谢变化，从而最大限度地提高其所产生的烃类产量和种类。代谢组学谱型分析与基因表达研究或蛋白质组学分析这些只揭示细胞中发生的一部分行为的研究不同，它能描述某一时刻细胞的完整生理状态。更重要的是，如果能把蛋白质组学、转录组学和代谢组学的数据整合在一起（一种称为系统生物学的整合性研究思路和方法），将获得生命有机体生物学更完整的图像。代谢组学“Metabolomics”与“Metabonomics”“Metabonomics”的定义是“定量测定生物系统对生理和病理刺激以及基因改变的动态、多参数代谢应答”，这一术语源自伦敦帝国理工学院。“metabolomics”是由一位­­­­­重要的代谢组学研究者OliverFiehn首次提出的，他当时在德国MaxPlanck研究所工作。一般来说，“metabolomics”的使用更为广泛。目前普遍认为，“metabolomics”主要指研究总体代谢谱，而“metabonomics”则是描述生物干扰所引起的多种（但不一定是全部）代谢物的变化。实际上，这两个术语在使用上多有重叠，常常不加区分。代谢组学的一般研究流程代谢组学分析通常有两种主要方法（图1）。发现代谢组学(DiscoveryMetabolomics)发现代谢组学一般包括：•代谢谱分析（也称为差异表达分析），在一组实验和对照样品中，寻找丰度改变有统计学意义的感兴趣代谢物•鉴定，进行代谢谱分析后，测定这些代谢物的化学结构•解释，研究流程的最后一步，解释所发现的代谢物与生物过程或生物状态之间的关联靶向代谢组学(TargetedMetabolomics)靶向代谢组学分析的重点是采用大量天然和生物变异样本，验证预先确认的代谢物。需要用分析标准品进行定量分析。代谢组学引言图1.代谢组学分析包括发现和靶向两种方法。在完整的代谢组学实验室中，数据将由多个分析平台产生。一个软件包，如安捷伦的MassProfiler专业软件，将支持所有仪器，提高效率并确保一致的、可靠的结果发现与鉴定MassProfiller专业软件靶向GC/MS单四极杆鉴定GC/MS三重串联四极杆寻找特征统计学分析通路分析统计学分析定量LC/MSQ-TOFLC/MS三重四极杆质谱在代谢组学中的应用质谱(MS)因具有广泛的动态范围、能进行可重现的定量分析，而且能够分析非常复杂的生理体液，已被用于代谢组学的研究中。由于这类样品的复杂性，为了尽可能多地检测代谢物，在质谱分析之前常常还要进行分离（气相色谱、液相色谱或毛细管电泳）。代谢组学中所用的分离技术因为样品非常复杂，所以分离是代谢组学的重要部分。分离的保留时间或迁移时间等化学信息可以用来追踪和鉴定正在分析的代谢物。这很有必要，因为质谱本身不能区分质量相同的代谢物，而色谱却能分离和鉴别异构体。两种最常用的分离技术是气相色谱(GC)和液相色谱(LC)。每种技术都有其长处和弱点。GC要求挥发性，要用化学衍生化的样品。尽管LC在多方面适用，但标准的反相分离还不能完全解决代谢组中亲水组分的分离问题。虽然毛细管电泳(CE)对亲水代谢物的分离非常有效，但所用的缓冲液却不能与质谱仪的离子源兼容。随着新色谱柱化学的发展，如亲水相互作用色谱(HILIC)，可能会替代CE在LC/MS中应用。将分离与质谱结合在一起，形成了一种非常灵敏而快速的方法，可以检测含有几百到几千种化合物的样品。没有其它的分析方法如此适合这项任务。代谢组学的挑战典型的代谢组学实验需要大量样品才能得到精确统计的结果。由于代谢物存在巨大的化学多样性，以及在丰度上的巨大差异，代谢组学研究通常需要多种技术；某种类型的样品往往比其他样品更适合采用某种特定的分析技术。完备的代谢组学实验室通常会将GC/MS和LC/MS都作为其分析方法。除了需要高度灵敏和精确的仪器之外，强大的软件工具对处理这些实验所产生的大量数据也非常重要。所需要的软件功能包括，处理GC/MS和LC/MS数据的色谱解卷积程序、寻找有意义代谢物的一系列统计分析工具、帮助鉴定代谢物的代谢物数据库，以及最终绘制分子间相互作用网络图的生物信息学软件等。4GC/MS分析气相色谱和质谱(GC/MS)是分析挥发性化学物质的有效组合。气相色谱使用运载气推动分析物通过涂渍的熔融石英毛细管。基于分析物在气相和毛细管内涂层之间的不同分配实现分离。GC/MS要求分析物能够挥发，以便在毛细管中进行迁移。因此，分析物必须具有挥发性，或能够经过化学衍生具有挥发性。某些类型的样品尤为适用于GC/MS分析（见图1）。例如植物萜烯和精油，这些化合物具有挥发性，而且用LC/MS技术不能充分电离。游离脂肪酸经过衍生后，也可以用GC/MS进行分析。气相色谱具有高色谱分离度，可以分离用HPLC非常难分离的结构相似的脂肪酸。对于游离脂肪酸的分析，GC/MS比LC/MS的灵敏度更高。其它可以采用GC/MS分析的分析物还包括，类固醇、甘油二酯、单、二和三糖，以及糖醇等。电子轰击电离(EI)是GC/MS最常用的电离技术，非常耐用而且重现性好，而且不会受离子抑制的影响，离子抑制指的是一种化合物能够抑制其共洗脱化合物电离的效应。电子轰击电离产生特征性的质谱裂解方式。因此，未知物的EI图谱可以通过检索EI谱库得到鉴定。5由于内源性代谢物种类繁多，要进行真正全面的代谢组学研究既需要GC/MS也需要LC/MS技术。实际上，绝大多数代谢组学实验并不全面，一般只采用GC/MS和LC/MS中的一种方法，影响在二者之间做出选择的因素包括，代谢物的化学性质、样品基质，以及实验经费。本节概述了GC/MS和LC/MS的某些定义特征，并提出了在其之间进行选择时应当考虑的因素。还针对使用的GC/MS和LC/MS系统进行代谢组学研究工作的主要步骤提供了指南。选择GC/MS或LC/MS研究代谢组学的原因图1.化合物分类及其最适的分析技术ࡂྛࣅᄆิ࿿ૌܾๆྛ໗৛ᆳḇૌၑଙᕘဗ็છࣩ݀࿿ૌࢲ஄տ໎ૌࣜཛྷኬዊᆶऐ໗ᆶऐӃࢃᔉ૗ጱ႙ᄣ೗ࢃᔉ໗ܠӃटႠডၭटႠডٷGC/MSGC/MSLC/MSዘ۠ـૌิ࿿ॢૌҽए໗ְܹݱӃૌኬݜ໗ݱૌटႠᆶऐࣅࢇ࿿മଚ၇໎ૌૌࠦـૌ简单的鉴定方法只需要扣除了背景的EI图谱，和一个通用EI谱库检索，如NIST谱库。更有效的鉴定方法是采用包含了预期的化合物保留时间和EI图谱的特定应用数据库同时对分析物的色谱保留时间和质谱图进行检索。目前，还没有专门的内源性代谢物公共EI谱库。EI电离经常会导致分子离子的丢失，如果在谱库中找不到匹配的EI谱，缺少的分子离子的质量信息将使可能的化合物的数量变得非常庞大。虽然可以用互补化学电离(CI)保留分子离子，但却又失去了EI裂解所能提供的结构信息。因此，GC/MS最适合对已知的或预期的代谢物进行分析