基因芯片技术

基因芯片技术2第一节概述第二节DNA芯片技术的操作流程第三节DNA芯片技术的应用3第一节概述一、基因组序列数据库及分子生物学研1.随着人类基因组（测序）计划（Humangenomeproject）的逐步实施，到2002年人类全基因组序列的测定成功。2.分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多动植物、微生物的基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。究现状二、基因芯片的概念基因芯片（Genechip）又称DNA芯片，DNA微阵列(DNAmicroarray)，或寡核苷酸微阵列(oligonucleotidearray)，是一种重要的生物芯片，它是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交反应检测生物信息。基因芯片电子芯片集成电子线路集成分子线路三、基因芯片的原理把大量已知序列的探针集成在同一个微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)上，将已被荧光标记过的靶核酸序列与芯片上的探针进行杂交，经洗涤后(除去未杂交的样品)，便可通过处理和分析基因芯片杂交图象，对生物细胞或组织中的基因信息进行分析，基因芯片能够在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。四、基因芯片的发展一·世界发展史1980年：埃德温·迈勒·萨瑟恩（EdwinMellorSouthern）提出的核酸杂交理论，即标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交。从这一角度而言，Southern杂交可以被看作是生物芯片的雏形。弗雷德里克·桑格（FredSanger）和吉尔伯特（WalterGilbert）发明了现在广泛使用的DNA测序方法，并由此获得了诺贝尔奖。1983年：卡里·穆利斯（KaryMullis）首先发明了PCR，以及后来在此基础上的一系列研究使得微量的DNA可以放大，并能用实验方法进行检测，因此获得了诺贝尔奖。•二十世纪九十年代，人类基因组计划(HumanGenomeProject，HGP)和分子生物学相关学科的发展也为基因芯片技术的出现和发展提供了有利条件。•1992年：运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片；•1993年：设计了一种寡核苷酸生物芯片；•1996年运用照相平板印刷、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、寡核苷酸合成及荧光标记探针杂交等多学科技术创造了世界上第一块商业化的生物芯片；•1995年，斯坦福大学布朗（P．Brown）实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。二十世纪后生物芯片产业化2000-2004年的五年内，在应用生物芯片的市场销售达到200亿美元左右2005年，仅美国用于基因组研究的芯片销售额即达50亿美元，2010年上升为400亿美元二·中国发展史1997~1998我国开始生物芯片研究，起步较晚，但发展迅速从2000年开始，国家陆续投入大笔资金，建立了北京国家芯片工程中心、上海国家芯片工程中心、西安微检验工程中心、天津生物芯片公司、南京生物芯片重点实验室共五个生物芯片研发基地截止到2006年，我国生物芯片的产值已达到2亿多元。西安、南京、深圳、哈尔滨等地近50家生物芯片研发机构和30多家生物芯片企业蓬勃发展的局面。我国已有500余种生物芯片及相关产品问世，10余个芯片或相关产品获得了国家新药证书、医疗器械证书或其他认证，并已实现产业化生产。20世纪科技史上两件影响深远的事：•一是微电子芯片，计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；•二是基因芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。15五、DNA芯片的特点高度集成化大通量平行分析大规模高灵敏度样品需要量小六、基因芯片的分类1、按其片基不同：无机片基芯片、有机合成片基芯片2、按其应用不同：表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片3、按其结构不同：DNA阵列、寡核苷酸芯片4、按其制备方法：原位合成芯片、点样芯片17第二节DNA芯片技术的操作流程DNA芯片技术操作流程图芯片的制作直接购买商品化芯片自行设计并向厂方定做购买芯片点样仪、玻璃片基或膜；购买/合成OligoDNA或大规模PCR扩增目的片段；点样及固定；自制芯片样品的制备和标记待测样品核酸提取与纯化标记标记靶片段纯化分子杂交图像采集和软件分析反转录标记/PCR标记/随机引物标记等19一、芯片的制作准备：点阵设计（芯片上核酸探针序列的选择以及排布）固定在芯片上的生物分子样品固相支持物（即芯片片基）制作芯片的仪器211.固相支持物的种类及预处理刚性支持物：玻片、硅片、瓷片膜性支持物：尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜膜结合玻片、FASTSlides等原位合成法的支持物：衍生出羟基等活性基团直接点样法的支持物：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸芯片制备方法（1）原位合成（insitusynthesis）适用于：寡核苷酸①光导原位合成法②原位喷印合成③分子印章多次压印合成（2）点样法适用于：大片段DNA、寡核苷酸、mRNA①接触式点样（针式打印）②非接触式点样（喷墨打印）2、基因芯片的制备原位合成法（insitusynthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。美国Affymetrix公司专利光敏保护基团；光蚀刻掩膜（或蔽光膜）原位合成法：合成速度快、步骤少、探针数目呈指数增长、阵列密度高；但光蚀刻掩膜昂贵、每步产率较低，因此合成探针长度较短。测序、查明点突变；高密度、根据已知的DNA编制程序；制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNA序列。•点样法设计点阵人工合成的寡核苷酸片段；PCR、RT/PCR等扩增的DNA或cDNA片段；基因组提取的DNA片段；表面带正电荷的芯片支持物阵列点样机(arrayer)喷墨打印（非接触式）400点/cm2针式打印（接触式）2500点/cm2紫外交联固定、Schiff碱连接法固定Cartesian-PixSysSeriesSpotBotTM个人化全自动芯片点样仪31二.待检测样品的制备和标记1.待检测样品中mRNA或DNA的提取及纯化–RNA的稳定性•液氮或干冰;立即抽提•RNA保护剂–纯化2.RT、RT-PCR或PCR扩增靶片段固相PCR系统323.样品的标记•伴随RTorPCR过程•随机引物法、缺口平移法等•标记物荧光染料，如Cy3、Cy5生物素、地高辛放射性核素，如32P、33P化学发光金属离子Au和Ag(纳米金属微粒探针)•双/多色荧光标记•标记产物纯化33Cy3、Cy5双色荧光标记结果示意图34三.分子杂交芯片杂交盒、洗片器；芯片杂交仪杂交液清洗液影响杂交的因素时间、温度、缓冲液等，根据芯片上核酸片段的长短、用途选择杂交条件351.预制的基因芯片2.芯片滚动杂交仪3.全自动芯片洗涤工作站4.芯片扫描仪5.分析系统1234536四.杂交图谱的采集和分析1.磷感屏成像系统2.荧光芯片扫描仪3.图像分析和数据处理软件基于光电倍增馆（PMT）的检测系统CCD摄像38Asuccessfulmicroarrayexperiment:Relativelylowbackgroundandhighanduniformsignalsinthisimageprovideabasisforcomparisonofthemicroarrays.Highbackground39第三节DNA芯片技术的应用一、基因芯片的应用1药物筛选和新药开发由于所有药物都是直接或间接地通过修饰、改变人类基因的表达及表达产物的功能而生效，而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况（蛋白质芯片）的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验甚至临床，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。2疾病诊断基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。基因细胞组织脏器个体全身在临床疾病诊断中的应用3环境保护在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。4司法基因芯片还可用于司法，现阶段可以通过DNA对比来鉴定罪犯，未来可以建立全国甚至全世界的DNA指纹库，到那时以直接在犯罪现场对可能是疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行分析，并立刻与DNA罪犯指纹库系统存储的DNA“指纹”进行比较，以尽快、准确的破案。5现代农业基因芯片技术可以用来筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，也可以用于基因扫描及基因文库作图、商品检验检疫等领域。目前该类市场尚待开发。46二.基因芯片的发展方向1.减小实验误差，提高精确度2.基因芯片的数据处理3.降低成本4.资源共享5.基因芯片与其他类型芯片的有机结合6.基因芯片技术的国产化47谢谢各位！