转基因动物与动物生物反应器

第九章转基因动物与动物生物反应器转基因动物转基因动物培育技术转基因动物的应用动物乳腺生物反应器转基因动物转基因超级鼠1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中，培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。转基因动物（transgenicanimal）的概念指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后，随细胞的分裂而扩增，在体内表达，并能稳定的遗传给后代的动物。即指基因组中整合有外源基因的一类动物。整入动物基因组的外源基因被称为转基因(transgene)。转基因技术克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。建立转基因动物时，外源基因可能只整合入动物的部分组织细胞的基因组，也可能整合进动物所有组织细胞的基因组中。我们把只有部分组织的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物(mosaicanimals)。嵌合体动物只有当外源基因整合进去的部分组织细胞恰为生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代；否则，外源基因将不能传给子代。动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合体动物。当外源基因在转基因动物体内表达，并培育出其表型与人类疾病症状相似的动物模型，则称其为转基因动物模型。Gordon等首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序小鼠。1982年，Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。目前建立转基因动物的主要策略有两种：一种是让转基因在动物体内过度表达的方法。最常用的是显微注射方法。转基因可用基因本身的启动子，也可拼接组织特异性表达的外源启动子；可转入单基因，也可转入双基因。另一种方法是让基因在体内灭活，丧失其功能，即基因敲除技术。这就是近年来发展的用胚胎干细胞进行基因打靶技术，以产生基因缺陷的转基因动物。转基因动物的制作方法1、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（ES细胞）法3、逆转录病毒感染法4、体细胞核移植法5、精子载体法1、雄原核显微注射法以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的雄原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。ExpressionofExogenousGenes这一方法的实验程序如下：（1）目的基因的制备与纯化通过酶切方法获取DNA，以质粒作为载体，转化到E.coli扩增质粒，分离纯化重组质粒DNA，酶切为线状基因片段。（2）准备卵供体母鼠和假孕母鼠（养母）超排卵处理供体母鼠，与正常雄鼠结合；假孕母鼠与结扎雄鼠结合。（3）基因导入（基因显微注射法）在显微操作仪上，用注射针将纯化后的目的基因注射到受精卵的雄原核内（4）胚胎移植受精卵发育到桑椹胚或囊胚期时，移植到假孕母鼠的子宫内。（5）对幼鼠的鉴定取出生幼鼠DNA，用PCR、Southernblot等在基因水平检测目的基因，用Northernblot和Westernblot等方法在转录、蛋白质水平上检测目的基因的表达。获得阳性鼠（首建鼠）。（6）建系将首建鼠与同品系正常鼠交配，当F1代阳性率为50％，选择性状好的转基因小鼠进行近亲繁殖，再从子代中，选择纯合子个体进行交配，建立转基因小鼠近交系。实验流程图优点：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；方法简单，导入过程直观；整合率较高：30％缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性2逆转录病毒感染法逆转录病毒(retrovirus)作为转基因载体是目前应用较成功的一种基因转移方法。主要是利用逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性的特点，将外源基因连接到LTR下游进行基因重组后，再包装成为高浓度病毒颗粒，去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中。携带外源基因的逆转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的高度整合特性，可大大提高基因转移的效率。缺点：转入的外源基因的大小受到限制,一般在10kb以下。获得纯合体的转基因动物的机会少。病毒载体构建复杂。可能出现病毒自身基因的复制表达问题等。3胚胎干细胞（ES细胞）法将外源基因导入体外培养的ES细胞。可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。胚胎干细胞法制备转基因动物的方法:通过电穿孔等基因转化技术将DNA转入体外培养的ES细胞。在体外经过适当的筛选和鉴定，将所得到的符合设计要求的细胞克隆。经过囊胚腔注射等方法注入受体囊胚。将受体囊胚移植入假孕母体子宫，继续发育产生嵌合体;再利用生殖系嵌合子代，设计适当的交配育种,获得纯系转基因动物。InjectionofEScellsintoblastocysts优点：外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。该方法遗传修饰能力强且十分精确,基因转移操作简便,具有良好的应用前景。缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易动物育种需经过嵌合体途径，受ES细胞的生殖嵌合能力以及交配机率的影响，实验周期较长。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。精子载体法近年来利用精子作为外源基因载体来建立转基因动物较为令人注目。将精子与外源DNA进行预培养之后,使精子有能力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植,这样产生的动物也会使外源基因得到表达。精子携带DNA主要是通过三种途径来完成,即将外源DNA与精子共孵育、电穿孔导入法和脂质体转染法。优点：精子载体法涉及的基因转化方法简便，效率高;动物育种不经过嵌合体,实验周期短,尤其对于大家畜的转基因研究具有潜在意义。缺点：但该法和“受精卵显微注射”途径一样具有目的基因整合的随机性、无法早期验证修饰事件等不足之处。体细胞克隆法首先要将目标基因转移到体外培育的动物体细胞中,筛选出阳性转基因细胞并进行繁殖,制备出供移植用的细胞核供体。将转基因细胞核供体移植到去核的卵母细胞中,重构胚胎经过激活和培养后,移植到代孕动物中。该法将体细胞核移植技术与转基因技术结合起来。Wilmut研究小组通过体细胞核移植,率先在世界上培育了表达人凝血因子的转基因克隆绵羊。优点：后代均为转基因个体。移植前，可选择后代性别。仅一代就可建立转基因群体，节约时间和费用。体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛,但在基础理论和实验技术上还需进一步探索。转基因动物的应用（1）基因表达与调控的研究将转基因导入动物受体细胞内,研究该基因在体内的表达调控特征及其相应的生物学效应,这是转基因动物的一种应用途径。当转基因动物的外源目的基因插入某一内源基因后,可能会破坏该内源基因的功能,造成某一基因功能的缺失。通过这种基因剔除的方法可阐明某一特定基因在发育过程中的功能。转基因动物还能体现基因表达的相对特异性和组织分布规律。如通过导入人生长激素释放因子(hGRF)基因与金属硫蛋白启动子建立的转基因鼠，在不同的组织，hGRF表达水平不同。在垂体和胰脏中，呈高水平表达；在下丘脑和肝脏中呈中水平表达；在心脏和性腺中呈低水平表达。这表明了基因表达的特异性和组织分布规律。（2）人类疾病的转基因动物模型研究转基因动物模型被认为是遗传学研究中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆技术之后的第四代技术。将产生某些疾病或遗传病的基因作为外源基因,构建出人类疾病和遗传病的转基因动物模型,帮助人们研究疾病的发生机制和发展过程。应用致癌病毒和细胞的癌基因培育转基因小鼠,为肿瘤研究提供了新的途径。目前,已经培育出了动脉粥样硬化、镰刀形红细胞贫血症、痴呆症、自身免疫病、淋巴系统病、真皮炎及前列腺癌等多种疾病的模型动物,为这类疾病的研究提供了方便。（3）动物品种改良通过外源基因的导入，改造动物的基因组,可达到使家畜、家禽的生长速度加快，肉、蛋或奶产量及品质提高，饲料利用率提高、抗病力加强的目的。目前应用最广的是，通过此技术改变牛奶的品质和成份。在我国已获得转人乳清白蛋白、人乳铁蛋白等转基因牛奶，为我国的“人源化牛奶”产业化定了重要的基础。与常规育种技术相比，转基因动物育种具有：周期短、成本低、选择效率高、不受有性繁殖的限制等。是转基因动物最具经济开发前景的领域之一。（4）人体器官移植异源器官移植可能是解决器官短缺的有效途径。狒狒器官太小，无法长期维持人的生命；黑猩猩太珍稀；灵长类动物都可能含有传染病因子。在其他非灵长类动物中，猪在许多理性方面与人类具有较多的相似性。因而猪在提供人类移植所用的器官方面成为首选的供体（免疫排斥转基因猪）。目前，实施器官移植数量最多的是肾移植。（5）基因治疗是将人正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。基因治疗有二种形式：一是体细胞基因治疗，正在广泛使用；二是生殖细胞基因治疗，能引起遗传改变而受到限制。常规治疗：对疾病的治疗针对的是由基因异常而导致的各种症状；基因治疗：针对的是疾病的根源——异常的基因本身。治疗方法有二种：基因工程细胞植入法（Invitro）从患者体内取出有基因缺陷的细胞进行培养，利用基因转移进行遗传修正，然后将修正后的细胞进行选择和培养，通过移植的方法再转入患者体内。临床实际应用存在一定困难。产业化生产的可能性小。基因直接导入法(Invivo)将具有治疗功能的基因直接导入病人的靶细胞中。临床应用方便，产业化生产可行。（6）基因打靶就是通过同源重组，将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因的一项技术。它克服了随机整合的盲目性和危险性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。包括：基因剔除技术与基因替换技术基因剔除技术（knockoutofgene）利用基因同源重组，用无功能的外源基因转入细胞，与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术也叫基因敲除。基因敲进（knockinofgene）利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中，与其基因组中同源序列进行同源重组，把原来的同源序列置换出来，并使外源基因在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进。也称基因替换。基因打靶流程图•基因打靶的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。•基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。基因打靶研究获得2007年诺贝尔奖马里奥·卡佩奇（MarioCapecchi），奥立佛·史密斯(OliverSmithies)、马丁·埃文斯(MartinEvans)一同获得2007年度诺贝尔生理学或医学奖。埃文斯成功解决了干细胞在体外情况下进行分化、维持生长、生殖特性的技术问题，对胚胎干细胞