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RNA干扰/shRNA原理及设计RNAi概述:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默,是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencingandtransgenesilencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰,可以特异地将特定的基因沉默,从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低,因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等。RNAi基本原理示意图:RNAi类别:1、siRNA合成:原理:在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点,特别适用于基因靶位点不确定情况下,进行siRNA有效片段的筛选。2、microRNA干扰载体构建:原理:载体采用PolII启动子表达人工设计的微小RNA(miRNA),后者从长的转录本被加工,进而导致特异性的mRNA的降解。3、shRNA干扰载体构建:短发卡RNA(shRNA)是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA(siRNA,19-21个核苷酸的RNA双链)的DNA分子。我们可根据靶标设计短发卡RNA(shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。4、慢病毒RNAi:原理:慢病毒是逆转录病毒的一种,具有逆转录病毒的基本结构,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性,作为基因治疗载体发展起来,最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体,与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,lentivirus-shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。5、腺病毒RNAi:原理:腺病毒(adenovirus,AV)是一种没有包膜的线状双链DNA,它能感染分裂细胞和非分裂细胞,在核内以神经元细胞的形式复制,存在多种AV血清型。到目前为止,构建的绝大多数载体都是基于血清型2和5,通过转基因的方法取代E1或E3基因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在表达高水平E1和E3基因的细胞中复制,因此适合应用于治疗的高效控制系统。腺病毒载体能够高效传递和表达基因的能力(尤其是在体外),由于具有宿主范围广,对人致病性低;在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因;能有效进行增殖,滴度高;与人类基因同源;不整合到染色体中,无插入致突变性。对于难转染的细胞,如原代或非分裂细胞,采用病毒递送miRNA/shRNA的方式是非常有效的选择。几个概念的区分:shRNAs(RNA-ShorthairpinRNAs):即短发夹RNA,是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,可通过RNA干扰来抑制基因的表达。ThomasRosenquist和GregHannon小组联合研究了在哺乳动物种系细胞中shRNAs的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。microRNA(miRNA,微小RNA)是由内源性发夹(hairpin)结构转录产物衍生而来的一种长为19nt~25nt的单链RNA。在每种高等动物中,存在200种以上的miRNA,是最大的基因家族之一,约占基因组的1%。siRNA:(short/smallinterferingRNAs):即小干扰RNA,是一种短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,这个过程就是RNA干扰途径(RNAinterferencepathway)miRNA,siRNA,dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子RNA,其不同之处在miRNA是单链RNA,其余均为双链RNA;siRNA和dsRNA相似;shRNA需通过载体导入细胞后,然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。miRNA与shRNA图示:
本文标题:RNA干扰shRNA原理及设计
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