第3章-固定化生物催化剂反应过程动力学

第三章固定化生物催化剂反应过程动力学第一节固定化生物催化剂概论酶固定化的意义酶固定化的方法影响固定化酶反应动力学的因素均相酶反应系统的缺点酶随产物排出，无法重复使用；增加产物纯化难度；不稳定，易变性失活一、什么是固定化酶？通过物理或化学的方法使溶液酶结合在不溶于水的载体上，或被限制在有限空间内，能与反应液分离，保留在反应器内或能够被回收并反复利用，不溶于水但仍具有酶活力的酶固定化酶的优点容易从反应体系中分离可以重复使用机械强度和稳定性增加便于连续化、自动化生产固定化技术的发展固定化酶固定化细胞•1916年Nelson和Griffin发现酵母蔗糖酶能被骨炭粉末吸附并在吸附状态下仍具有催化活性，后来科学家开始了固定化酶的研究。•首例工业化应用固定化酶是1969年由Chibata及其同事在日本TanakeSciyaku公司实现的，他们将米曲酶（Aspergillusoryzae）的氨基酰化酶固定后用于拆分合成的外消旋DL-氨基酸，得到相应的旋光性的对映体。二、酶的固定化方法载体结合法交联法包埋法1、载体结合法物理吸附法共价键法离子键法1）物理吸附法活性炭、硅胶、硅藻土、陶瓷。酶活收率高结合力弱，易脱落简便易行操作流程：将酶溶液溶解于缓冲液中，加入载体，振荡或者搅拌一定时间后，抽滤、洗涤、冷冻干燥，得到固定化酶。2）共价键法利用氨基、羟基、胍基、咪唑基等反应活性高的未结合基团。易失活、酶活收率低结合牢固3）离子键法离子静电引力离子交换树脂操作简单酶活收率高结合力弱，易脱离2、交联法酶与具有两个或两个以上官能团的试剂反应戊二醛特点•不需要载体•反应剧烈，酶活收率低•结合牢固3、包埋法将酶包埋在凝胶的微小格子或微胶囊等有限空间内聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙、琼脂。特点•包埋法只适合于底物和产物均为小分子物质的酶的固定化•酶活收率高•制备成本高概念：酶活力收率酶活力收率是指实际测定的固定化酶的活力(E3)与固定化时所用的全部游离酶的活力(E1+E2+E3)之比，包括因未固定化而损失的酶活(E1)E3实测酶活E1残留在溶液E2固定化造成的失活概念：酶的活力表现率酶的活力表现率是指实际测定的固定化酶活力(E3)与被固定化的酶在溶液状态时的总活力之比(E2+E3)E3实测酶活E1残留在溶液E2固定化造成的失活固定化酶促反应动力学3.1固定化酶促反应动力学基础3.1.1酶的固定化技术定义酶的固定化技术是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电吸附，共价键等与载体如角叉菜胶、离子交换树脂等材料制成固相酶的技术。细胞的固定化技术:为省去从微生物（或动、植物）中提取酶的操作，确保酶的稳定性，采用直接固定化微生物细胞、动植物细胞、组织技术。物理吸附法载体结合法离子结合法共价结合法交联法格子型包埋法微胶囊2.3.1.2酶和细胞固定化方法3.1.3固定化对酶性质的影响底物专一性的改变稳定性增强最适pH值和最适温度变化动力学参数的变化3.1.4影响固定化酶促反应的主要因素分子构象的改变位阻效应微扰效应分配效应（可用Kp定量描述）链接扩散效应（可定量描述）分配系数(Kp)链接分配系数：载体内外底物(或其他物质)浓度之比。Kp的测定：已知底物浓度(CS0)，体积(V0)的溶液中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度(Cs)。3.2固定化酶促反应过程分析3.2.1外部扩散过程以表面固定化酶为例CSCSS外扩散过程分析外扩散速率：达到平衡时，即酶促反应速率：N,rrmaxNmax0CSSCS(CSS，rout)NmaxN，rrmax0CSSCS(CSS，rout)Da准数:当时，过程为外扩散控制。当时，过程为反应控制。式中:表明C*为Da准数的函数，即(时,)表明为C*的函数，即可见，Da准数是决定效率因子和比浓度C*的唯一参数，因而是表征传质过程对反应速率影响的基本准数。Da准数越小，固定化酶表面浓度越接近于主体浓度CS，越接近于1。Da准数越大，固定化酶表面浓度越趋近于零，越小，越趋近于零。为提高固定化酶外扩散效率,应设法减小Da准数。减小Da准数的措施：1、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面积，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应用中综合考虑，确定合适的粒径。2、使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大。3.2.2内部扩散过程具有大量内孔的球形固定化酶颗粒Rdrr内扩散效率因子稳定状态下，对底物进行物料衡算：流入量－流出量＝反应量整理,得两侧同除,得当反应符合米氏方程规律时，故,令,,,上式可转化为无因次形式，得边界条件:,,该微分方程无解析解，只能用数值法求解。西勒准数()的物理意义是表面反应速率与内扩散速率之比。对各类反应动力学与固定化酶的形状，普遍化的的定义式为:引入无因次参数，则无解析解，只有数值解。内扩散效率因子in是和的函数。对in影响不大，影响in的主要参数是西勒准数。如果，则不随变化，近似等于1，也就是说没有内部传质阻力，若，则，反应为内扩散所限制。为提高固定化酶内扩散效率，应设法减小。减小的措施主要是适当降低固定化酶颗粒粒径。外扩散过程内扩散过程Da准数是决定外扩散效率的唯一参数。准数是决定内扩散效率的主要参数。Da准数定义：西勒准数定义：外扩散效率因子定义：内扩散效率因子定义：Da1，过程为反应控制；Da1，过程为外扩散控制0.3时，过程为反应控制；0.3时，过程为内扩散控制。三、酶固定化后的变化底物专一性的改变pH活性曲线和最适pH的变化稳定性的变化四、影响固定化酶动力学的因素酶结构的改变位阻效应分配效应扩散效应1、酶结构的改变2、位阻效应立体障碍与底物分子的大小、形状及性质有关。3、分配效应分配系数K=Csg/Csi4、扩散效应外扩散内扩散研究方法建立包括传质速率和酶的催化反应速率在内的反应速率方程外扩散内扩散内外扩散同时存在第二节外扩散对反应速率的限制效应一、外扩散传质速率研究对象的简化理论模型Fick定律dLdCDdrdCDNSSS)(0SiSLSdCCakR二、宏观反应速率的求解外表面扩散速率（Fick定律）外表面反应速率)(0SiSLSdCCakRSimSiSiCKCrRmax动力学控制外扩散控制SdSiRRSdSiRR求取过程引入无因次变量SdSiRR]141[22KCS1KDa丹克莱尔准数★定义式物理意义Da1Da1三、外扩散有效因子动力学控制外扩散控制S0SirR＝酶外表面处的反应速率无外扩散影响时固定化酶外表面处的反应速率有外扩散影响时固定化E消除外扩散的方法对任意n级反应的有效因子n=1n=2naraCkrDaE111222)141(41DaDaE四、外扩散限制与化学抑制同时存在非竞争性抑制底物抑制139491758871、非竞争性抑制IIEIISSSSmIISimSiSSIEIKCKCCKKCCrCKKCCKCrrR1111)1(110max0max负协同效应2、底物抑制)(10maxSiSLSSiSimSSCCakKCCKrR0)1()1(00203SSiSSiSSiCCCCCKCK稳态操作点非稳态操作点第三节扩散对反应速率的限制效应问题的引出内扩散过程的特点一、载体的结构参数外表面积AP、比表面积Sg平均微孔半径颗粒体积VP、孔隙体积Vg孔隙率颗粒真实密度颗粒表观密度颗粒堆积密度tpb微孔内的扩散机理以浓度差为推动力•Knudson扩散•分子扩散（Fick定律）有效分子扩散系数DeHDDepp二、微孔内的浓度分布（球状固定化酶）简化假设•载体和酶均匀分布•等温、等De•不考虑酶的失活•扩散传质•浓度是半径的函数S流入速率－S流出速率＝S消耗速率rrrrdrdCDerdrdCDeSrSrrS2224)4()4(解与rs有关1、M-M方程SmSSSSCKCrrdrdCrdrCdDemax22)2(DeKrRmmax3SSSSCCrdCdrrdCd192222无解析解，只有数值解2、一级反应SSSCDeRkrdCdrrdCd21222方程的解21229rdd)3sinh()3cosh(1211rCrCDeKR113常数的求解)3sinh()3cosh(1211rCrC颗粒内底物浓度分布函数)3sinh()3sinh(110rRrRCCSS3、零级反应DekdrdCrdrCdSS0222rDekdrd022213061CrCrDek临界半径Rc最大颗粒半径Rmax)(6)1(6220022200RrDekCRrDeRkCCSSS20061RkDeCRRSC00max6kDeCRS三、微孔内的浓度分布（膜状固定化酶）理论模型（单面扩散）输入－输出＝消耗SSrdlCdDe221、米氏方程SmSSSCKCrrdlCdDemax222、一级反应)cosh()cosh(110LlCCCSSSDeKL11DeKL1123、零级反应临界厚度最大厚度)(22200LlDekCCSS20021LkDeCLLSC00max2kDeCLS梯勒模数Φ定义式物理意义动力学控制内扩散控制四、内扩散有效因子SiSRR＝反应速率颗粒内无浓度梯度时的颗粒内的实际反应速率1、球形固定化酶00max3SmSRrSSiSCKCrdrdCDeRRR一级反应RrSSdrdCCkDeR0113]31)3tanh(1[31110RCdrdCSRrS]31)3tanh(1[111101SSrR]31)3tanh(1[9112111RkDe零级反应03034kRRS033)(34kRRRCS20061RkDeCRRSC232000)61(1RkDeCS2、膜状固定化酶单面扩散双面扩散111tanh)cosh()cosh(110LlCCCSSS五、影响内扩散效应的因素一级反应的梯勒模数通式DekAVDeKrAVPPmPP1max1第四节内外扩散同时存在时的限制效应一级不可逆反应一、总有效因子实际反应速率/本征反应速率0SSTrR总有效因子的推导传质速率＝以外表面底物浓度为基准的反应速率SiSiSLSCkCCakR110)(DaCakkCCSLSSi1011011以外表面底物浓度为基准的反应速率＝以主体溶液底物浓度为基准的反应速率DaCkCkRSSiS10111110101111STSCkCkDaTDa111引入Biot准数DekAVLPP＝内扩散速率外扩散速率BiBiDa21BiDaT2111111第五节生物膜和菌丝团的扩散反应模型1、生物膜的扩散反应模型生物膜的厚度生物膜扩散-反应模型假设•生物膜内为单一菌种•单一限制性底物•生物膜拟稳态•薄的平板生物膜•生物膜内细胞相同2、菌丝团的扩散反应模型丝状菌内外传递速率的影响第六节扩散影响下的表观动力学特性一、对反应速率与浓度关系的影响00maxSmSSCKCrR0max11SmSCKRr二、对反应级数的影响任意n级反应nSrSCkR'nSrSCkRSrSCnkRlnlnlnlnSrSCnkRlnlnln'SCddnnlnln'DekCnAVnnSPPn121对于n级反应21lnln