第五章后-重组菌发酵

重组微生物反应过程一、概述二、宿主-载体系统三、利用基因工程菌生产的特点四、基因不稳定性五、重组大肠杆菌的高密度培养策略六、生长与表达的影响因素七、甲醇营养型酵母的生长和表达一、概述基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非蛋白质。非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。细胞因子、疫苗、酶产品最主要用于人的治疗，此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难性的。有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才有活性。治疗蛋白要求保证产品的质量和安全，降低成本并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。二、宿主-载体系统构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统，一般希望翻译后的处理要简单，如果用于食品要考虑宿主菌是否列入FDA表中，列入的认为是安全的菌。常用的宿主系统有：大肠杆菌G+细菌低等真核细胞哺乳动物细胞1、大肠杆菌如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的宿主。优点：人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作；大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）；大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大肠杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。其中主要是外源蛋白，但也含有其它细胞物质。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复性。大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。2、G+细菌枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的这一性质对生产非常有吸引力。然而枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的采用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所以在使用上有较大的限制，3、低等真核细胞酵母菌酿酒酵母是第一个被人利用的生物，它的最大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等。当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物细胞组织培养来达到。4、哺乳动物细胞哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转录后处理与在整个动物中相同，在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组DNA生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。三、利用基因工程菌生产的特点基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。四、基因不稳定性生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：分离丢失、结构不稳定性宿主细胞调节突变1、分离丢失当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。质粒可分为高拷贝质粒（20拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。四、基因不稳定性但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。1、分离丢失四、基因不稳定性1、分离丢失四、基因不稳定性2、质粒结构不稳定性除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的质粒占统治地位的菌。四、基因不稳定性3、宿主细胞突变宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。四、基因不稳定性4、生长速率占优势的不稳定性所有这三种因素的关键是改变了的宿主载体系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如果改变了的宿主载体系统比原来的宿主-载体系统有生长优势，那么改变了的系统将最终占优势，基因不稳定性就出现。表达的诱导基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。四、基因不稳定性五、重组大肠杆菌的高密度培养策略关键点：高密度、高表达菌密度的测定：光密度（OD值或A值）在波长600～660菌生长的障碍是重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会导致细胞中毒或死亡,因此工程菌的比生长速率往往远小于宿主菌。高表达的障碍是：外源基因的不稳定，造成表达的下降。高生长速率与高表达之间的矛盾乙酸的产生蛋白的降解五、重组大肠杆菌的高密度培养策略高密度培养的措施分批补料培养以分批培养为基础，吸取了连续培养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了菌体的生长过程。因此，要实现重组大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养法。现在常用的是反馈补料培养。有几种反馈控制控制基质浓度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生长速率的葡萄糖流加五、重组大肠杆菌的高密度培养策略五、重组大肠杆菌的高密度培养策略1、控制基质浓度流加用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效应，达到很高的细胞浓度。五、重组大肠杆菌的高密度培养策略2、恒pH流加大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨积累的原因。因此用葡萄糖代替酸液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了比生长速率的降低时间，细胞密度是无流加的2倍。可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适宜。五、重组大肠杆菌的高密度培养策略3、恒溶氧流加用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，从而减少氧饱和百分数，引起读数下降。当读数下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随之减少，氧的饱和百分数逐渐上升，从而达到供需平衡。Konstantinov等进一步发展了这种方法，用DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓度，从而获得高密度和高表达五、重组大肠杆菌的高密度培养策略4、控制比生长速率的葡萄糖流加菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切相关。比生长速率太大，超过某一值，易产生乙酸，这一比生长速率值称为菌体的乙酸产生临界比生长速率。通过考察得出最优比生长速率，控制溶氧、转速、补糖来控制比生长速率。五、重组大肠杆菌的高密度培养策略六、生长与表达的影响因素不同发酵条件下工程菌发酵结果通气量搅拌转速DOpHOD600诱导时间菌体湿重蛋白量111501.87.00.741.913.8%222502.67.80.7742.0816.7%335003.87.50.7462.1018.2%435004.07.00.8362.2726.4%535003.67.02.4465.1858.9%*鲤鱼生长激素基因工程菌1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发现当发酵液的溶氧为1.8~2.6ppm/L时，菌体湿重为1.9~2.08g/L外源基因表达量为13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到4.0ppm/L时菌体湿重为2.27g/L外源基因表达量为26.4%。在诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白产物的形成。六、生长与表达的影响因素2、pH值对工程菌生长和表达的影响在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白的表达不利，因此，表达开始要调节pH在6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表达。六、生长与表达的影响因素3、诱导时间对外源蛋白表达的影响诱导时间：加入诱导剂后的培养时间随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。诱导时间对酶表达水平和活力的影响诱导时间酶活力酶表达水平00.02152.337%2118.857%3120.867%4165.068%5139.964%*L-天冬酰氨酶六、生长与表达的影响因素4、诱导时机对表达的影响以天冬酰氨酶表达为例，见表。在A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速度明显受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受到影响。六、生长与表达的影响因素诱导时机对酶表达水平和活力的影响生物量（A600）酶活力酶表达水平0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%*L-天冬酰氨酶六、生长与表达的影响因素5、乙酸对生长和表达的影响（1）乙酸的产生及抑制作用机理当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密度发酵过程中，问题更为严重。乙酸的产生与细胞中的电子传递链