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微生物学实验淮海工学院海洋学院课程组人员:王淑军暴增海马桂珍王洪斌陈静制作人员:马桂珍暴增海课程简介微生物学实验课是微生物学课程教学中的一个重要环节。本课程总计36学时,使用教材是沈萍主编的《微生物学试验》(第三版)。通过本课程的学习,使学生了解微生物学的基本知识;巩固和加深所学理论知识;掌握微生物学最基本的操作技能。同时,通过实验,培养学生培养学生独立思考和理论联系实际能力;养成实事求是、严肃认真的科学态度,以及敢于创新的开拓精神;并在实验中进一步提高学生的科学素质修养。实验一显微镜使用及微生物形态观察实验二霉菌形态特征实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察实验四微生物的测微技术实验五酵母菌形态观察和死活细胞鉴别实验六玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌实验七培养基的配制和灭菌实验八微生物分离纯化及观察实验九显微镜直接计数法实验内容•实验十平板菌落计数法•实验十一微生物生长曲线的测定•实验十二理化及生物因素对微生物生长的影响•实验十三微生物的生理生化反应特性•实验十四微生物菌种保藏技术显微镜概述微生物的个体微小,必须借助显微镜才能观察到。因此,显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工具。所以,了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握不同显微镜的使用方法是很有必要的。显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。实验一显微镜使用及微生物形态观察•一、目的要求•1.学习显微镜的结构、功能和使用方法。•2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。基础知识尼康E-600显微镜二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理普通生物显微镜由3部分构成:•①照明系统:包括光源和聚光器。•②光学放大系统:由物镜和目镜组成,是显微镜的主体。•③机械装置:用于固定材料和观察方便,包括镜台(载物台)、调节器和、物镜转换器(旋转器)。•与其他物镜不同,油镜需在载玻片与镜头之间加滴镜油,原因有二:•1.增加照明亮度油镜的放大倍数可达100x,教具很短,直径很小,但所需要的光照强度却最大。为了不使通过的光线有所损失,必须造又精于加入与玻璃的折射率(n=1.55)相仿的镜油。通常用香柏油(n=1.52).•2.增加显微镜的分辨率油镜的分辨率可达到0.2μm左右。2.荧光显微镜尼康E800荧光DIC显微镜荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色)3.激光共聚焦扫描显微镜LCSM照片蓝色为细胞核,绿色为微管4.暗视野显微镜暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)的聚光镜中央有当光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4-200nm的微粒子,分辨率可比普通显微镜高50倍。一种介壳虫的染色体•5.相差显微镜•6.偏光显微镜•偏光显微镜(polarizingmicroscope)用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。7.微分干涉差显微镜DIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。DIC显微镜下的硅藻(伪彩色)8.倒置显微镜9.透射电子显微镜JEM-1011透射电子显微镜莱卡超薄切片机内质网透射电镜图(伪彩色)冰冻蚀刻电镜照片10.扫描电子显微镜JEOL扫描电子显微镜人类血细胞SEM照片11.显微操作技术尼康NT-88NE显微操作/注射仪显微镜的分辨率:也称为分辨力,它是指能把两个物点辨清的最小距离,分辨距离越大,则分辨率越低。所以,分辨率是以分辨距离来表示的。其计算公式为:D=0.61入/N·AN·A·=n·sina/2式中D为分辨率,A为光波波长,N·A·为物镜的数值孔径(镜口率)。在物镜上,有镜口率(N.A.)的标志,它反应该镜头分辨力的大小,其数字越大,表示分辨率越高,各物镜的镜口率如下表:物镜镜口率(N.A.)工作距离(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.300.11•显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积,•公式为:M=K1xK2•焦点深度:显微镜调焦到看清标本某一点时,不仅是这一物点,而且它的•上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全厚度,必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。厚标本和薄标本4-5um2um基础知识三、实验步骤•(一)显微镜的使用•1.观察前的准备工作•(1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯,观察时要双眼同时睁开,一边观察一边进行记录或描绘。•(2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。•(3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常,并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。瞳距调节2.显微镜的调节屈光度调节调节粗调松紧调节旋钮聚光镜中心调节⑤光轴中心调节螺钉③视场光栏③孔径光栏②10X物镜①标本④聚光镜升降旋钮孔径光栏调节N.A聚=(0.6-0.8)N.A物孔径光栏开度与图象100%70%30%孔径光栏的运用操作步骤如下:(1)可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水平是固定的,则装配时已保证它与聚光镜合轴,不必调整;如果可变光栏的水平位置可以移动,则应把可变光栏关到最小,使它的中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。(2)载物台上放置观察标本,把聚光器上升到它上端透镜平面稍低于载物台平面的高度,并将它的可变光栏开到最大,用低倍物镜,进行调焦到能看见标本,可调反射镜使视野得到最亮和最均匀的照明,或把光栏关小,最亮的照明区正处在视野的中央。(3)转到高倍镜,并调焦到看清标本,然后去掉标本,拔出目镜,眼睛直接向镜筒观察,并把可变光栏关小,看其亮点是否在视野中心,如果不是,就要转动聚光器的调节螺旋,把亮点调到视野中央,再慢慢开启可变光栏,使视野看到光栏边缘和聚光镜的边缘相接为止。3.观察操作(1)低、高倍镜的使用:先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片0.5cm处,然后一边观察视野一边上升物镜,直至看到图像,再将标本移到视野中心,用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处,若要用高倍镜观察时,把所要进一步放大观察的部位移至视野中央,直接顺时针转换成高倍物镜,然后用细调焦螺旋调焦,至看清物像。1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦,不能用手指或粗布,以保证光洁度3.观察标本时,必须依次用低、中、高倍镜,最后用油镜。当目视接目镜时,特别在使用油镜时,切不可使用粗调节器,以免压碎玻片或损伤镜面。4.拿显微镜时,一定要右手拿镜臂,左手托镜座,不可单手拿,更不可倾斜拿。5.显微镜应存放在阴凉干燥处,以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。四、显微镜保养和使用中的注意事项五、记录实验结果•绘图六、思考题•1.使用油镜时,为使么选用香柏油或液体石蜡作为物镜与玻片间的介质?其他液体行吗?•2.油镜用毕后,为什么必须把镜油擦净?用过多的二甲苯或用酒精擦镜有什么危害?•3.什么是物镜的同焦现象?他在显微镜观察中有什么意义?•4.观察时为什么要用左眼,并且两眼都应睁开?一、实验目与基本要求:学习并掌握观察霉菌形态的基本方法,了解常见霉菌的基本特征。二、实验内容:1.观察霉菌菌落形态。2.用显微镜观察霉菌装片。3.制作霉菌装片并观察其形态。实验二霉菌形态特征三、实验步骤(一)菌落特征的观察用肉眼观察生长在琼脂平板上的各种霉菌菌落,并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。1.菌落的大小:局限生长或蔓延生长,菌落的直径和高度。2.菌落的颜色:正面和背面的颜色,培养基的颜色变化。3.菌落的形态:棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮纹、放线状的皱褶等。霉菌菌落各种曲霉的菌落各种病原真菌的菌落青霉的菌落青霉的菌落霉菌菌丝A、无隔菌丝B有隔菌丝隔膜(二)个体形态特征的观察1.乳酸石炭酸制片法观察(1)制片:在干净的载玻片上加一滴乳酸石炭酸,用接种针从菌落边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液体中,再小心地把菌丝放开,然后用盖玻片盖上,注意不要产生气泡。(2)镜检:1)毛霉和黑根霉的孢子的形状、颜色、大小、孢子囊、中轴体的形状,有无假根和葡萄菌丝。2)黑曲霉的分生孢子的形状、颜色、大小、顶囊的形状、小梗排列隔膜。3)青霉的分生孢子的形状、颜色、大小、小梗的排列方式,菌丝的隔膜。(3)将观察结果绘图,并注意各部分名称。霉菌的静孢子左:毛霉的孢子囊;中:孢子囊壁破裂,露出静孢子;右:囊轴曲霉的分生孢子梗和顶囊上的分生孢子青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子曲霉的分生孢子头彩图霉菌的厚垣孢子2.插片培养观察:(1)插片培养:将已灭菌的盖玻片斜插入培养基平板上,一半露在外面,然后沿盖玻片与培养基交接处接种霉菌孢子悬液。24到26度恒温培养2到4天。(2)制片、镜检:以无菌操作取下盖玻片,有菌面朝下,放在滴有一滴棉兰染液的载玻片上。四、实验报告绘制镜检形态图1.毛霉和根霉形态图,示各部。2.青霉和曲霉形态图,示各部五、问题和思考1.什么叫载玻片湿室培养?它适用于观察怎样的微生物,有何优点?2.湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂?(一)实验目的(二)实验原理(三)实验器材(四)实验方法(五)注意事项(六)实验作业实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察革兰氏染色(一)实验目的1、学习微生物涂片、染色的操作技术;2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法;3、初步掌握无菌操作技术;4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。(二)实验内容及原理1.简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态,不能辨别细菌细胞的构造,通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红等)使其着色。Simplestains2.革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法,因为通过此法染色,可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。1234?结晶紫碘液酒精复红革兰氏染色的机理:主要由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同。•1、菌种:培养12-16h的枯草杆菌(Bacillussubtilis),培养24小时的大肠杆菌(Escherichiacoli)•2、染色液和试剂:草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红染液、复红、乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水•3、器材:废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。(三)实验器材1、简单染色(四)实验方法:制片→染色→水洗→干燥→镜检•(1)制片:取菌种培养物常规涂片、自然干燥、加热固定;注意无菌操作•(2)染色:将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上,加复红染色1-2min。•(3)水洗:用水洗去涂片上的染色液。•(4)干燥:将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。•(5)镜检:先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油一滴,将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。2、革兰氏染色制片→初染(结晶紫1min)→水洗→媒染(碘液1min)→水洗→脱色(乙醇20-30s)→水洗→复染(番红2min)→水洗→干燥→观察crystalvioletstainwashwithwaterStainwithgram'siodinesolutionDecolorizebyadding95%alcohol革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性杆菌CounterstainwithSafranin•①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净:•a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。•b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。•c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿,按号放入显微镜柜中。•②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净,放入回收容器内。(10)实验完毕后的处理•1、载玻片要洁净无油迹。涂片时,滴水不要过多,挑菌量宜少,涂片要均匀,菌膜宜薄。•2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。?(五)注意事项•3、染
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