紫杉醇的提取及分离纯化---studysyaueducn

紫杉醇的提取及分离纯化制作人：曲晓林符烊宁解说员：曲晓林•紫杉醇的结构（图）•紫杉醇的药用机理•紫杉醇的生产•生产技术的改良•目前存在的问题●中文名：泰素、安素泰、紫素、特素●英文名：Taxol略写：PTX分子式：C14H51NO14药用机理•紫杉醇独特的抗癌活性机制在于它属于有丝分裂抑制剂或纺锤体毒素，不但能抑制细胞的有丝分裂、纺锤体和纺锤丝的形成，从而阻止癌细胞的繁殖，而且能通过诱导和促进微管蛋白的聚合和装配，阻止微管发生解聚，使微管稳定，因而对于许多耐常规化疗药物的肿瘤有活性，应用前景十分广阔。最初的生产方式紫杉醇的来源最初是以天然提取为主，主要是从由红豆杉属植物的树皮中分离得到。红豆杉是生长极为缓慢的乔木或灌木，其树皮中紫杉醇的含量平均为万分之一点五，从中提取紫杉醇的收率大约为万分之一，这样支取1kg紫杉醇就需要树皮10吨，这种生产紫杉醇的方法严重破坏资源和环境。为解决紫杉醇大量供应的问题，认命蹭探索通过组织和细胞培养、化学合成等方法制取紫杉醇。紫杉醇的细胞工程化生产利用植物细胞培养生产次生代谢产物，首先要筛选含有目标次生代谢产物的植物及最好的基因型，选择合适的部位做外植体进行愈伤组织诱导。愈伤组织诱导过程中筛选合适的生长培养基，进行传代培养，经过多代培养，得到稳定生产的细胞系。从多个细胞系中筛选生长和生产状况最好的稳定的细胞系，对之进行生物合成途径、诱导、固定化及基因修饰等方面的研究，最终在反应器中进行发大生产，进行过程工程调控。紫杉醇大概的生产流程外植体取红豆杉当年生健康茎叶消毒灭菌接种到培养基上进行组织培养从细胞中分离紫杉醇并提纯关键步骤1外植体的选择•不同外植体诱导愈伤组织的能力和诱导的愈伤组织合成紫杉醇及紫杉烷的能力均不同。选择外植体时应考虑到外植体部位、取材季节、器官生理状态和发育年龄以及外植体的大小等。多次的实验表明幼茎是诱导愈伤组织最适合的外植体。2.高产菌株的筛选•解决植物细胞培养生产次生代谢物产量低的有效的手段之一是筛选高产细胞株系。高产细胞系的筛选有很多不同的方法，如选择含量高的外植体，单细胞克隆法，原生质体培养法、小细胞团法、抗性筛选法及负筛选法等。3.高产细胞系的建立及种质保存•将适量愈伤组织团转移到装有50ml液体培养基的150ml三角瓶中，置旋转式摇床上进行悬浮培养，摇床转速160r*min-1离心5min，收集单细胞及小细胞团，转移到新鲜培养基中进行继代培养，即可以得到悬浮培养的无性细胞系。•根据实验结果表明，生长旺盛的红豆杉基本上不启动次生代谢，只有当细胞群体处于对数生长后期，细胞的增殖基本停止，细胞有一定程度的分化后才开始合成和累积紫杉醇。针对红豆杉细胞生长和紫杉醇合成的特点，必须设计有针对性“两步培养法”以获得最佳产量。即第一步采用利于细胞生长增殖的生长培养基，以在最短的时间内得到最大的生物量，然后更换成有利于目标产物合成的生产培养基进行第二步培养，以得到最高的紫杉醇产量。4.培养基的选择•Abou-Man为基本培养基H为基本生产培养基•在此基础上进行调整优化。•ph5。4最适宜范围4.5~6.2•20ml/L的水杨酸，100uml/L的茉莉酸甲酯和10mg/L的F5真菌诱导子对紫杉醇合成促进效果相对较好。但总的来说，单因子对紫杉醇合成的促进作用都不明显，最高含量也仅为干重的0.7/万左右。1固定化细胞培养植物细胞有细胞壁和大的液泡，对剪切力十分敏感，易受机械损伤。固定化细胞培养技术是在可控条件下使植物悬浮培养的细胞聚集成团并且限制在特定空间和表面上，使这些细胞团在不损失生物量的同时能连续不断地分泌次生代谢物质。固定化的方法主要有吸附在载体上，包埋在多孔凝胶珠或微胶囊中。目前这一技术应用中遇到的难题是次生代谢产物释放的问题，因为大部分次生代谢产物都储存在液泡内，对其自身的积累起着负反馈作用，使固定化培养不能连续操作。另外，长时间的固定化培养也易使细胞受污染。2.两段培养法生长与生产非偶联型的培养体系，细胞的最适生长条件和最适生产条件是不同的。两段培养法就是根据这点，把培养过程分为细胞生长期和次生代谢物生产期2个阶段。在不同阶段分别采取不同的培养条件，在细胞生长期使接种细胞大量繁殖，提高比生长速率，尽快获得高密度细胞；在生产期则可保持细胞的高密度，维持存活率，降低细胞死亡速率，持续获得目标产物。3.两相培养法两相培养法植物细胞两相培养是在细胞外创造一个储藏次生代谢产物的单元（如固体吸附剂），从而打破原有产物在细胞内、外水相的平衡，使目的产物产量大幅度提高。采用两相培养技术可以减少次生代谢产物的反馈抑制作用，保护次生代谢产物免受酶的分解，简化下游处理过程，除去培养基中的有害物质。4前体饲喂前体指处于目标代谢物代谢途径中上游的物质，加入前体可以消除关键酶的阻碍或阻断内源性中间体的分隔和有效贮存，利于次生代谢物的生产。草酸钠是紫醇C-10位乙酰基的前体物，加入后虽然可提高紫杉醇产量，但幅度有限；柠檬酸是紫杉醇三环二萜合成的前体物，加入后对紫杉醇合成的影响相对明显；α-苯丙氨酸和β-苯丙氨酸均是紫杉醇C-13侧链的前体物，若添加浓度合适，会对紫杉醇合成产生较大影响。研究发现，单种前体的加入对紫杉醇产量的影响不大，不同前体配伍可明显提高紫杉醇产量。紫杉醇及紫杉烷细胞工程生产存在的问题•（1）许多建立起来的红豆杉悬浮培养细胞系不生产紫杉醇，只生产另一代谢支路的14位氧化的紫杉烷。（2）提高紫杉醇及紫杉烷产量的调控策略大多集中于生物合成过程，较少留意后生物合成过程——紫杉醇及紫杉烷合成后的运输、贮藏、分泌、降解等过程。事实上，紫杉醇及紫杉烷最终的产量高低不仅取决于生物合成能力，也取决于生物合成后的贮运分解情况。