Gus染色试剂配制及使用方法

Gus染色试剂盒●产品组成：组分货号名称规格贮存Huayueyang-GT0391x-gluc染色液1ml-20℃Huayueyang-GT0392GUS染色缓冲液50ml4℃●产品简介：gus(β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶)基因是目前常用的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-gluc.htm'target=_blankx-gluc）分解为蓝色的物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应用。该试剂盒包含GUS染色的全部试剂，使用方便，只需将染色液和缓冲液按照比例混合即配成GUS染色液。该试剂盒可以配制50mlGUS染色液。●贮存和效期：X-gluc染色液-20℃保存；GUS染色缓冲液4℃贮存。自开封之日起有效期一年。●使用说明：一.GUS染色液配制：X-gluc染色液为50×浓缩液，使用前用GUS染色缓冲液稀释50倍即配成GUS染色液。如0.1mlX-gluc染色液加入到5mlGUS染色缓冲液中，即配成5mlGUS染色溶液。该染色溶液最好现用现配，短期贮存可以-20℃保存2-3天。二.GUS染色步骤：1.将准备好的材料浸泡在GUS染色液中，于25-37℃保温1小时至过夜。2.叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。3.肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。注：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片（1-3mm）。当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物和酶渗入细胞。GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。GUS染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。GUS能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。GUS表达水平的定量测定（1）取100μl蛋白上清，加入400μl37℃预热的GUS提取缓冲液里，再加入500μlMUG底物，37℃温浴。在0min、15min、30min、45min和60min分别取混合反应物200ul加入到800ul反应终止液，室温避光保存。（2）用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值。（3）以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。（4）用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。