腺相关病毒操作手册

腺相关病毒1腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-AssociatedViralVector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。AAV的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AAV的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AAV病毒整合、复制和装配中其重要作用。图1.AAV基因结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AAV对人体致病，重组AAV基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AAV2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；（汉恒--AAV包装）三、重组腺相关病毒载体系统简介AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AAV腺相关病毒2无辅助病毒系统（AAVHelper-FreeSystem）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。在AAVHelper-FreeSystem中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A，E4等基因）大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。AAV-293细胞是HEK293细胞经过改良腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。野生型AAV基因组由病毒rep和cap基因（分别编码AAV复制和包装相关的基因）及位于两侧的表达和包装必须的顺式作用元件——反向末端重复序列（InvertedTerminalRepeats，ITRs）组成。在AAVHelper-FreeSystem中，rep和cap基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC中，AAVITRs仍位于病毒载体中。在辅助质粒的帮助下，仅需两端的ITR就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒，因此，rep和cap基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。由于不再需要活的辅助病毒，AAVHelper-FreeSystem提供一个更安全，更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。图2.AAVHelper-FreeSystem腺相关病毒系统三、重组腺相关病毒载体不同血清型腺相关病毒3研究发现AAV具有多种血清型，各种不同血清型的AAV载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前汉恒生物在包装腺相关病毒时有9中不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见表1。血清型组织亲和性AAV1肌肉，心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织AAV2中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼，AAV3肌肉，肝脏，肺，眼AAV4中枢神经，肌肉，眼，脑AAV5肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺AAV6肺，心脏AAV7肌肉，肝脏AAV8肝脏，眼，中枢神经，肌肉AAV9心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经表1.9种不同血清型对各组织器官细胞的亲和性汉恒生物（Hanbio）提供各种血清型AAV包装。四、AAV病毒包装(一)AAV-293细胞的冻存随着传代的次数增加，AAV-293细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。1、去掉细胞培养上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。腺相关病毒43、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL37℃预热的10％DMEM，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。4、细胞离心，1000rpm/min，5min。去掉上清。5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）重悬细胞，密度为3x106个/ml。6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。（二）AAV-293细胞的传代当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。3、根据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。（三）AAV-293细胞的复苏当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。1、设置温度为37~42℃的水浴。2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min内使细胞溶液完全溶解。3、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm/min，5min。4、去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm培养皿。5、将培养皿平稳放入37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。腺相关病毒5（四）AAV包装和浓缩1.质粒扩增构建好的AAV载体、包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1ug/ul，A260/280在1.7-1.8间方可用以包毒。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。2.传AAV-293细胞将培养AAV-293细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL37度水浴中预热的10％DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-400万/T75。每瓶T75加10mL10％DMEM培养基。转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。3.做脂转complex注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipofiterTM说明书。4.AAV病毒收毒：病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。1)准备一个干冰乙醇浴（将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴）和37°C水浴；2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。收集细胞时，将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中；试剂名称试剂数量载体质粒5ul(1.0ug/ul)包装质粒5ul(1.0ug/ul)辅助质粒5ul(1.0ug/ul)腺相关病毒63)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1mlPBS重悬；4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37°C水浴中反复转移，冻融四次。每次融解后稍加震荡。注意：每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。5.AAV病毒浓缩：1)10,000g离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中。2)将两次收集的上清混合在一起，用0.45um滤器过滤除杂质3)加入1/2体积的1MNaCl，10%PEG8000溶液，混合均匀，4度过夜4)12,000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22um滤器过滤除菌。5）加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA（终浓度为50U/ml）。合上管盖，颠倒几次以充分混合。在37°C孵育30分钟；6）用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的AAV病毒。6.AAV的纯化1）向病毒浓缩液中添加固体CsCl直到密度为1.41g/ml（折射率为1.372）；2）将样品加入到超速离心管中，用预先配好的1.41g/mlCsCl溶液将离心管剩余空间填满；3）在175,000g下离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有AAV颗粒的组分；4）重复上述过程一次。5）将病毒装入100kDa的透析袋，4度透析脱盐过夜。此即为纯化的AAV病五、AAV病毒包装滴度测定（采用Q-PCR法）1）取20ul浓缩病毒液，加入1ulRNAse-freeDNAse，混匀，37℃水浴反应30min。2）4℃，12000rpm/min，离心10min，取10ul上清到另一个无菌的1.5mlEP管中。3）加入90ulDilutionBuffer（1mMTris-HCl,pH8.0，0.1mMEDTA，150mMNaCl），混匀，37℃金属浴反应30min。4）自然冷却至室温，加入1ul蛋白酶K，65℃水浴反应1h。5）100℃金属浴反应10min，自然冷却至室温。腺相关病毒76）进行Q-PCR检测滴度。六、AAV病毒的储存、稀释1.病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）。1）病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新测定病毒滴度。2）反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融，建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。2.病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS缓冲液或培养目的细胞无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完)分装后使用。七、使用安全注意事项1．病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。2．病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。3．操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液等请用84消毒液或1%SDS中浸泡过夜后弃去。4．用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。5．如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心