培养基配制及灭菌

1广东食品药品职业学院实训教学教案（2010～2011学年第一学期）课程名称食品微生物检验技术实训项目培养基的配制与灭菌技术课时2教学对象10食品安监1-4授课日期12月3日教材王瑞兰主编《食品微生物检验技能实训教程》，本院自编（2010年8月）教师姓名王瑞兰教学方法演示法、练习法实训形式2人一组实验实训中心签字实训目的1、了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制的基本程序。2、熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。3、熟悉玻璃器皿的包扎方法。4、了解高压蒸气灭菌的原理与方法。教学内容与要求内容：1、固体、液体培养基的配制2、玻璃器皿的包扎方法要求：1、了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制的基本程序2、熟悉玻璃器皿的包扎方法3、了解高压蒸气灭菌的原理重点难点培养基的配制的基本程序仪器天平、称量纸、玻璃纸、药匙、精密pH试纸、量筒、试管、锥瓶、玻璃棒、烧杯、培养皿、1ml吸量管、涂布棒、试管架、铁丝筐、棉花、线绳、报纸、灭菌锅等。试剂蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、营养肉汤培养基、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液。2教学过程设计教学过程设计[板书]一、实训目的1、了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制的基本程序。2、熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。3、熟悉玻璃器皿的包扎方法。4、了解高压蒸气灭菌的原理与方法。[板书]二、实训原理（一）培养基的配制1、培养基：是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。它是微生物接种、分离培养的基础。2、培养基的配制原则：①适宜的营养成分；②适宜的pH值；③适宜的渗透压；④合适的物理状态3、培养基的分类按物理状态：液体培养基、固体培养基和半固体培养基。（二）高压蒸气灭菌利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。一般培养基用0.1Mpa，121.5℃，15～30min[板书]三、实训步骤（2人一组）（一）培养基配制基本程序原料称量→溶解→调pH值→加琼脂熔化，补水（固体培养基用）→过滤（可以省去）→分装→加塞包扎、做标记→灭菌→摆斜面或倒平板1.称量药品根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2.溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中（做标记），在电热套中小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。33.调节pH根据培养基对pH的要求，用1mol/LNaOH或1mol/LHC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸4.溶化琼脂固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂和剩余水量加入后（做水的刻度标记），置电热套中一面搅拌一面加热煮沸，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。5.过滤分装先将过滤装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。6.包扎标记培养基分装后加好棉塞，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备班级、组别和日期等。（二）培养基的配方及本次实验的需要量1、营养肉汤培养基（培养细菌）每组配制50ml，直接称取营养肉汤培养基18g水1000ml1）计算与称量：根据需求计算各成分的量，并准确称量2）配制：直接称取营养肉汤培养基0.9g,，加热溶解于50ml蒸馏水中，调节pH值至7.0～7.2。分装两支试管，15-20ml/支，加棉塞、包扎，121℃高压灭菌15min备用。2、营养肉汤琼脂培养基（细菌的分离培养，观察菌落）每组配制180ml牛肉3g(0.6g)蛋白胨10g(1.8g)NaCl5g(0.9g)琼脂15～20g(3.2g)蒸馏水1000ml(180ml)1）计算与称量：根据需求计算各成分的量，并准确称量2）配制：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，然后用1mol/L的氢氧4化钠或者1mol/L的盐酸，校正pH至7.2～7.4。再加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，补水定容。分装4支试管和2个锥瓶，试管装量为10ml/支，锥瓶装量为55ml/瓶，加棉塞、包扎，121℃高压蒸气灭菌15min。（三）分离培养微生物常用器皿的准备1、玻璃仪器的清洗：培养皿6套，1ml吸量管2支、涂布棒2支2、玻璃仪器的包扎：培养皿6套包成一包、1ml吸量管2支、涂布棒2支。（四）培养基和玻璃器材的灭菌高压蒸气灭菌（因实训室条件有限，高压蒸气灭菌无法由学生完成，高压灭菌锅的使用在课堂讲解）1、加水打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。2、装料、加盖灭菌材料放好后，将灭菌盖上的软管插入灭菌桶的槽内，关闭灭菌器盖，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。3、加热排气及升温灭菌打开放汽阀，加热，自锅内开始产生蒸汽后3min再关闭放汽阀（或喷出气体不形成水雾），此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排尽，温度随蒸汽压力增高而上升，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时，一般培养基控制在0.1MPa灭菌20min，关闭热源，停止加热，压力随之逐渐降低。4灭菌完毕降温及后处理待压力降至接近“0”时，打开放气阀，取出灭菌材料。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。斜面培养基自锅内取出后要趁热摆成斜面，灭菌后的空培养皿、试管、移液管等需烘干或晾干。5、灭菌后的培养基存放灭菌后的培养基经检查灭菌彻底后，可放冰箱中保存备用。5注意事项1、称量原料时注意：蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速，且用玻璃纸称量；2、溶解培养基的烧饼装好原料和水后，记得在烧杯上划线做记号，方便补水。3含琼脂的培养基一定要煮到完全溶解才可以分装；4、培养基分装后加好塞子，加塞后再用牛皮纸或报纸包好瓶（管）口，用橡皮圈或棉线扎紧。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。棉塞松紧适宜，棉塞2/3塞进瓶口，1/3留在外。5、高压灭菌锅使用的注意事项（1）锅内水分要充足，灭菌物品装量不宜太满。（2）灭菌初期先排净锅内冷空气再升压。（3）灭菌时间计算：达到规定压力和温度才开始计时（4）灭菌结束需缓慢减压，趁热取出灭菌物品。预习思考题1、制备培养基的一般程序是什么？答：原料称量→溶解→调pH值→加琼脂熔化，补水（固体培养基用）→过滤分装→加塞包扎、做标记→灭菌→摆斜面或倒平板2、培养基中加琼脂的作用是什么？课后记6