酵母单杂交手册(translated-by-mony)

酵母单杂交手册目录1简介2试剂盒包含的内容3缩写4Y1HGold酵母菌株的相关信息5附加材料&酵母培养基AcDNA扩增、文库构建和筛选所需的附加材料B相应的培养基要求6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建A方法：合成、克隆p目的基因-AbAi质粒B方法：构建诱饵-受体酵母菌株7利用AbAr的表达检测诱饵菌株A方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度8cDNA文库的构建A方法：利用SMART技术合成cDNA第一链B方法：利用LongDistancePCR(LD-PCR)扩增cDNA第一链C方法：利用CHROMASPIN+TE-400Columns技术纯化合成的双链DNA9单杂交的文库的构建和筛选A方法：单杂交cDNA的文库的构建和筛选10结果分析11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离A方法：通过划板确认受体表型B方法：酵母菌落PCR以消除DuplicateClones（假阳性克隆？多拷贝？）C分离和纯化文库中可靠的具有受体活性的质粒D方法：区分阳性克隆和假阳性克隆E分析阳性克隆的序列12问题排除指南13参考文献附录A：质粒信息附录B：酵母生长培养基的配置及所需营养物附录C：SMART技术原理图表图1利用MatchmakerGoldOne-HybridSystem筛选蛋白-DNA的相互作用图2将相应的片段整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株图3利用SMART技术和酵母的特点构建和筛选你的文库图4通过菌落PCR确认pBait-AbAi构建成功图5利用SMART技术合成cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec图6利用SMART技术进行扩增图7利用CHROMASPIN+TE-400技术并收集产物图8说明受体基因表达阳性克隆和假阳性克隆之间的活性差异图9通过共转化选择性培养基验证相互作用图10pAbAi载体和做对照的p53-AbAi载体图谱图11pGADT7-Rec载体图谱图12pGADT7载体图谱表格表1Y1HGold酵母菌株基因型表2利用各种SD培养基验证Y1HGold酵母菌株的表型表3AbAr本底表达的预期结果表4RNA总量与最佳循环数直接的关系表5MatchmakerGoldOne-Hybrid问题排除指南表6Set1酵母培养基和Set1Plus酵母培养基的组分表7MatchmakerGoldProtocols所包含的每一个内容1简介A介绍MatchmakerGoldYeastOne-HybridLibraryScreeningSystem为建立酵母单杂交cDNA文库的建立提供了一个简单高效的方法。MatchmakerGoldSystems具有AbA抗性因而具有很强的筛选能力，可极大地降低背景水平。这种单杂交方法是在酵母双杂交的方法上演变而来，可以识别和分析蛋白质与DNA之间的相互作用，而不仅仅是证明蛋白之间的相互作用。（图1）图1.利用MatchmakerGoldOne-HybridSystem筛选蛋白-DNA的相互作用将一至三个目的DNA重复序列克隆至pAbAi报告载体，然后整合到Y1HGold酵母基因组中以构建一个诱饵特异的报告菌株。一旦文库中的猎物蛋白质与诱饵序列相结合，就会激活AbA抗性(AbAr)基因的表达。酵母单杂交文库同时通过酵母细胞进行构建和筛选，以此得到活体内的重组质粒，使用这种方法无需通过大量繁琐步骤克隆、扩繁、获取大肠杆菌E.coli内构建的文库。MatchmakerGoldSystem方法中的文库构建用到了SMARTcDNA合成技术，只需从任意组织部位提取总量为100ng的RNA，即可使用该方法构建cDNA文库。B酵母单杂交的原理——蛋白-DNA互作的一种实验方法诱饵（Bait）——DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或随即拷贝克隆到pAbAi载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株（图2）图2.通过同源重组将构建好的pBait-AbAi整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株。ura3-52基因位于Y1HGold，常态下不活跃，造成不可逆的转座子中断现象，只有通过与野生型中的URA3gene同源重组才可以修复。而pBait-AbAi载体就包含URA3gene。当用BstBI或BbsI酶切表达载体后，pBait-AbAi载体呈线性化，用来转化Y1HGold，转化产物可以在SD/-Ura培养基（缺尿嘧啶）的培养基中生长，这些克隆中也包含稳定的Bait-AbAi，可以用来筛选蛋白-DNA之间的相互作用。C猎物（Prey）在Matchmaker酵母单杂交方法里，可能结合DNA的蛋白，或者说猎物蛋白，被融合到含有酵母GAL4转录激活结构域（GAL4AD）表达载体中进行表达，通过共转化SMARTPCR扩增的cDNA和线性化的pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱饵报告菌株中可以直接构建好酵母中的猎物文库（图3）图3利用SMART技术和酵母的生物学特性，在酵母中同时构建和筛选文库。在酵母中同时构建和筛选cDNA文库。首先，利用SMART技术构建cDNA文库，这些cDNA文库的序列末端与线性化的猎物载体pGADT7-Rec末端具有同源序列。将cDNA文库和pGADT7-Rec共转化到Y1HGold-Bait报告菌株中，在酵母中进行同源重组。将酵母细胞涂布于SD/-Leu/+AbA培养板上，以筛选表达报告基因的阳性的Y1H相互作用。探寻蛋白-DNA的相互作用——AureobasidinA(AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度(0.1-0.5礸/ml)下即可对酵母产生毒性。包含AbArgene（AUR1-C突变基因）的转化酵母菌株pBait-AbAi可以获得抗生素抗性。当猎物蛋白（Prey）结合到诱饵序列（Bait），GAL4AD就会激活AbAr的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长（图1）。MatchmakerGoldOne-hybrid技术可被用于：鉴定新的蛋白-DNA的互作验证已知或可疑的蛋白-DNA的互作明确存在互作的蛋白结构域和同源的DNA序列方法总述：（包含以下步骤）第一步：将目的基因（bait）克隆到pAbAi载体上第二步：将构建好的pBait-AbAi质粒转化到Y1HGold酵母菌株中（图2）第三步：测试Y1HGoldbait菌株的AbAr背景表达水平第四步：通过共转化和体内同源重组构建和筛选cDNA文库（图3）第五步：确认和解释筛选结果ATTENTION:Successfuluseofanyyeastone-hybridsystemdependsuponno/lowrecognitionofyourtargetsequencebyendogenousyeasttranscriptionfactors,whichcancausehighbackgroundexpressionofthereportergene.ForthisreasonitiscriticaltotestyourY1HGold[Bait-AbAi]strainforAbArexpression(AbAresistance)beforescreeningalibrary(seeSection6).注意！酵母单杂交系统是否可靠取决于内源酵母转录因子不识别/几乎不识别你的目的片段，如果能识别该目的片段将造成报告基因很高的背景表达。因此，在进行文库筛选前要严格测试酵母菌株Y1HGold[Bait-AbAi]AbAr的表达（可产生AbA抗性）2试剂盒包含的内容TheMatchmakerGoldYeastOne-HybridLibraryScreeningSystem(Cat.No.630491)包含的材料可以构建5个酵母单杂交文库，推荐使用Advantage®2PCRKit(Cat.Nos.639206&639207)试剂盒扩增SMARTcDNA来获得双链DNA（dscDNA）3缩写4Y1HGold酵母菌株的相关信息表1是Y1HGold酵母菌株的基因型，表2是在不同SD（营养缺陷型）培养基上的表型。若想了解更多关于酵母生长和繁殖的信息，请查阅GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology(Guthrie&Fink,1991)5附加材料&酵母培养基AcDNA扩增、文库构建、文库筛选所需材料进行PCR时DNA聚合酶的稳定性。推荐使用theMatchmakerGoldkit扩增SMART单链cDNA，并以此为模板，用Advantage2PCRKit(CatNos.639206&639207)扩增dsDNA。利用Advantage2聚合酶混合物扩增cDNA(aslargeas20kb)比常规PCR具有更高的保真性。MatchmakerGoldYeastOne-HybridLibraryScreeningSystem不包含Advantage2PCRKit。限制性内切酶BstBI或BbsI，可使pBait-AbAi质粒线性化，帮助其更好的转化并整合到Y1H-Gold中。（酵母菌落PCR确认pBait-AbAi质粒已整合到Y1H-Gold基因组中，用rTaq即可）（PCR仪）其他实验室常规试剂、酶以及质粒构建、扩增、鉴定等所需试剂。详见individualprotocolsforrequirements。B酵母培养基及所需营养成分（详见附录B）（AbA，已买，具体介绍、使用说明等见附录B）酵母培养基（附录B有每一个组分购买、配制等详细介绍说明）YPDA是用于培养所有S.cerevisiae酵母菌株的一种常规的丰富培养基。附加的腺嘌呤（adenine）可阻止酵母因继代培养代数过多而变成粉红色。SD培养基(syntheticallydefinedmedium)是用于S.cerevisiae酵母菌株培养和质粒转化鉴定的一种minimalmedia。SDbase培养基包含了一个酵母细胞生长所需的所有最基本的东西，包括碳源和氮源。而各种重要的氨基酸分别加到SDbase培养基中就形成了minimalmedia。Clontech’sYeastMediaPouches已经包含了预先混合好的各组分。根据转化质粒的抗性标记基因选择不同的minimalmedium以供含有转化质粒的酵母菌株生长。SD/-UraDOsupplement（缺乏尿嘧啶的SD培养基内容物）用于鉴定bait-reporter是否构建整合到YIHGold菌株中。SD/-UraDOsupplement中包含了酵母生长所需要的所有营养物质，除开尿嘧啶（这是公司规模化生产的一种商品，DO就是droppedout的意思）。因为pAbAi质粒编码一个URA3基因，其产物就是尿嘧啶。因而整合了该质粒的酵母菌株可以在缺乏尿嘧啶的培养基中生长，而普通的酵母细胞中该基因处于抑制状态，不能自己合成尿嘧啶，则不能在这种缺陷型培养基上生长。SD/-Ura/AbA*培养基。若preyproteins与baitsequence之间存在相互作用，就会产生AureobasidinA抗性，用于筛选的AbA的浓度要根据每个酵母菌株的不同采用滴定法进行确定。6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建在开始实验前请仔细阅读该说明书，克隆目标基因详见方法A。获得Y1hgoldtargetreporterbaitstrain详见方法B。A．方法：构建pBait-AbAi质粒pBait-AbAi质粒必须包含至少一个目的DNA拷贝，插入到pAbAi载体AbAr受体基因的上游，(具体说明见TargetSequenceNotes)。许多研究表明高效的质粒包含三个目的基因的串联拷贝，但是在有些情况下单拷贝也能满足条件。有多种方法可以获得串联拷贝，其中利用寡核苷酸合成（引物合成）是最为方面可靠的办法，尤其是合成20bp的常规片段。（设计引物时两端酶切位点应不同mutantbait载体作为负对照，方法见Section10若有已知的与目的序列互作的蛋白，可将其整合到pGADT7vector作为正对照）1