抗氧化实验方法

1还原力的测定样品2ml加到2ml0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml10%的TCA，混合后以3000rpm离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值大小而定。0.2mol/LpH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。比色皿的用法：可见光(400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。2DPPH自由基清除活性的测定将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1mmol/LDPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为：空白为1.5ml95%的乙醇加入1.5ml蒸馏水调零。式中：Ac——对照为1.5mlDPPH溶液加上1.5ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5ml95%的乙醇在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5mlDPPH溶液在517nm处的吸光值；注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。0.1mmol/LDPPH乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。3在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25mmoll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。对照管除不加样液外其他试剂同前。将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，静置10min后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为:SA(%)=(Ac一AS)/AC×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一加入样品的吸光度注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度进行调整。硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶内保存。并以50mmol/LNaOH溶液配制。再在50℃水浴溶解。FeSO4溶液应以棕色瓶盛装。4过氧化值的测定参照本食品学院林华娟等老师主编的食品分析实验讲义一书。5超氧阴离子自由基清除率的测定邻苯三酚自氧化速率（V对照）：对照组和空白对照组加入4ml蒸馏水（去离子水）和，0.1mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2)4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组加入0.2ml（或0.3ml）3mMol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替。震匀后马上在320nm处测定吸光值。迅速混匀并开始计时，每隔30s读取吸光值,4min后结束，以空白对照管调零。作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对照。（V对照在0.05A/min~0.065A/min之间，否则应调整邻苯三酚加入量）样品自氧化速率（V样品）：样品组和空白组均加入一定浓度的样品溶液4ml，0.1mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2)4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组加入0.2ml（或0.3ml）3mMol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替。震匀后马上在320nm处测定吸光值。迅速混匀并开始计时，每隔30s读取吸光值,4min后结束，以空白管调零。作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品，按下式计算样品对超氧阴离子的抑制率：式中：抑制率(%)=(V对照-V样品)/V对照×100V对照－对照组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)V样品－样品组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)动物实验资料：摘自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效果受到多种因素的影响，只有在生物体内具有抗氧化作用的物质才能有效的清除体内产生的自由基，才能表现出一定的生物活性。由于体外抗氧化测定方法容易操作，周期短，因此评价一种物质的抗氧化效果往往首先采用体外抗氧化体系。但体外抗氧化体系往往与人体内的生理环境相差太大，许多研究结果表明采用体外方法评价有效的抗氧化剂进入人体后却表现不出应有的抗氧化效果，因此抗氧化剂的抗氧化效果在采用体外方法进行初步评价后应采用动物实验进行体内评价。人体在正常生理代谢过程中会产生少量的含氧自由基，如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等，这些自由基通过自然存在于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维生素E组成的抗氧化系统来消除。因此，在正常状态下，体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡中，正常量的自由基对细胞的生长、分裂、解毒等具有有益的作用，在杀菌、免疫调节等方面具有积极而重要的意义。然而，随着增龄或在某些病理状态下以及机体受到创伤时，体内抗氧化酶活性下降，从而导致机体代谢异常而骤然产生大量活性氧自由基；或由于机体抗氧化物质不足，使促氧化剂与抗氧化剂之间的平衡失常，致使自由基与机的一些生物大分子，如蛋白质、核酸、脂质等发生反应，生成大量氧化物或过氧化物，并进一步引起细胞死亡和组织损伤。业已证明，氧化损伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉硬化、神经退行性病变以及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染等均有密切关系。D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型是按照衰老的代谢学说建立的，其机制与糖代谢紊乱[6]、D-半乳糖醇中毒[7]和活性氧自由基过剩有关；众多研究表明是生物体内含有半乳糖氧化酶，在催化D-半乳糖时可产生超氧阴离子自由基(O2·-)和H2O2；如果长期人为地给予过量D-半乳糖，使机体和细胞内自由基产生过量，除了造成组织细胞直接损伤外，还导致抗氧化酶活力下降和过氧化产物积累，从而表现出与人类自然衰老相似的生化变化、免疫功能低下、基因表达与调控异常细胞繁殖力下降及细胞退化性衰变等。有研究表明，D-半乳糖可降低人胚肺二倍体成纤维细胞(HBS)，从而使该细胞SOD活力降低和过氧化产物MDA增多，从而起到加速细胞老化的作用。本文在前述章节已经表明，鹰嘴豆蛋白酶解物具有体外抗氧化活性，但其在生物体内的作用效果尚不清楚。为此本章采用D-半乳糖诱导致衰老小鼠作为模型，分别以小鼠的血清、肝脏和心脏组织中的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性作为评价指标，探讨鹰嘴豆蛋白酶解物在生物体内的作用，为揭示鹰嘴豆蛋白酶解物对体内过氧化状态的影响，明确其物质基础和相关机制提供证据。