抗氧化酶活性等测定方法

1叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol200ml;40%Percol200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mMMESPH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mMNaCl，2mMMgCl2，2mMEDTA，0.5mMKH2PO4，2mMASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mMHEPESpH7.6，含0.33mM山梨糖醇，10mMNaCl，2mMMgCl2，2mMEDTA，0.5mMKH2PO4，2mMASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点，含叶绿素2mg.ml-1以上，这样有利于保持活性。6、2000g1min;7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5，可以不做)8、用Percol试剂进行梯度离心（将3ml含有80%Percol（原液按100%算）铺在10ml离心管下层，再把3ml40%Percol铺在离心管中层，然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层）1500g2-3min（用水平离心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到1），下降也要缓慢下降，否则会破碎Percol的浓度梯度层的形成，取出会看到3层绿色带，最上层为破碎的叶绿体，沉在地层的为粗颗粒，40-80%的Percol之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体;9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度达到1mg.ml-1；（计算：取叶绿体悬浮液0.1ml，加4.9ml80%的丙酮，摇匀后于1000g离心2min，上清液置于1cm的比色杯，在625nm上比色，按照公式计算：OD625nm×50/34.5=叶绿素mg/ml）10、测定叶绿体的完整性，完整率达到85-95%；参考：TakedaK,OtauboT,KondaN.ParticipationofhydrogenperoxideintheinactivationofCalvin-cycleSHenzymeinso2-furmugatedspinachleaves.PlantandcellPhysiology,1982,23:1009-1018.2取上述制备的完整叶绿体进行如下测定：1、用50mMPBS（保护酶或其他测定项目的缓冲液）稀释2-5倍，用于测定SOD、POD、CAT、APX；2、用冷丙酮稀释2倍，取0.5ML提取液用于测定H2O2；（本试验中用0.2mol/LHClO4稀释）3、用5%的TCA稀释2-5倍，取1.5ml用于测定MDA；4、用乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1稀释，用于测定叶绿素；抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。（上述试剂先配好，放到4度冰箱，用之前临时按下面的方法配，然后放在4度冰箱中，不要在最上层，避免见光，第一组样品加好后拿出来加，加完后放回冰箱，第二组的样品加好后再拿出来加）酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml（加的量和前面的浓度要核对），磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；SOD反应混合液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml)（2）分别取3ml反应混合液和30μl（可视情况调整，最好先做一个浓度梯度，看加多少合适，如果量太少，最好稀释后再加，这样精确）酶液于试管中（尽可能加到试管的底部，要靠着试管壁打下去先加酶液，后加反应液，加好后摇一摇，看看试管上是不是有雾气，最好拿纱布把试管下边擦一下，免得雾气挡住光线照过去）；（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；（照光很重要，试管要选择相同规格的，3因为不同的试管透光率是不一样的，试管架不要选择遮光的，这个最好分组做，同时几组做相互之间会遮光，每一组一个重复，就是每一组中都要有所有的处理，且都要有一个最大管，处理多的话，把根和叶分开做，最大管放在中间）同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μlPBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。SOD总活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4)123ml和B母液(NaH2PO4)877ml混匀即为1000mlPBS(0.2M，pH6.0)；（2）反应混合液配制（以60个样为准）：取200mlPBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。POD反应混合液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml,0.076ml,0.112ml)（3）样品测定：取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4）酶活性计算：以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。2、过氧化氢酶（CAT）活性测定（1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)457.5ml和B母液(NaH2PO4)292.5ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。（2）反应液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。4CAT反应液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml,0.3092ml)（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。（4）酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=[ΔA240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml,0.1ml）。三、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定（缓冲液为K）1、试剂配制（按50个样计算）：（1）0.05mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH7.0）的配制：（A）K2HPO4·3H2O：228.22×0.05×0.61=6.9607g（B）KH2PO4：136.09×0.05×0.39=2.6538g，以上两者混合起来用去离子水定容到1L。（2）0.1mMEDTA-Na2：取0.01861gEDTA-Na2用PBS溶液定容到500ml（372.24g/M×0.1mM×500ml=0.01861g）；（3）5mMAsA：取0.044g抗坏血酸用PBS溶液定容到50ml（现用现配，176.13g/M5mM×50ml=0.044g）；（4）20mMH2O2：取0.2ml,30%H2O2用去离子水稀释到100ml（30%H2O2为550g×30%/(34.01g/M×0.5L)=9.703M）。实际配置0.1mMEDTA-Na2：3个处理*2个品种*3次重复*1.7ml*3次测定=91.8ml;（实际配置250ml,0.009305g）5mM的AsA:3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50ml,0.044g）20mMH2O2:3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50ml,0.1ml）2、酶活性的测定（以2ml体系测定）（1）取0.10ml酶液（可视情况调整），加入1.70ml含0.1mMEDTA-Na2的PBS（0.05mol/L，pH7.0），再加入0.10