抑菌实验步骤

抑菌实验：待测菌金色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；绿脓杆菌菌种活化：菌种，进行活化，可以划线，也可以涂布，划线：直接用接种环在酒精灯上烧过之后，等之冷却，蘸取进行划线！涂布：用枪头吸取100ul的菌液涂布既可！本实验采用涂布法1.金色葡萄球菌最佳生长条件(过夜培养一般为12h)2.枯草芽孢杆菌培养条件（过夜培养）3.绿脓杆菌最佳培养条件（14-17h）培养基MH（A）培养基(Mueller-HintonAgar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏）5g；酪蛋白水解物17.5g；淀粉1.5g；琼脂12.5gMH液体培养基配制方法：称取本品36.5克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，琼脂15g，NaCl5g，双蒸水1000mL，pH7.2-7.5，121℃灭菌20min。牛肉膏蛋白胨液体培养基：不加琼脂，其他同牛肉膏蛋白胨固体培养基。菌悬液的配制将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养24h，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL菌悬液）于5mL的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10-10、10-11）的浓度100μL做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL药品溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度，使其含菌体数为103cfu/mL，即为供试菌悬液。抑菌作用初步筛选将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml培养基倒入无菌培养皿中。待平板自然晾干后，分别移取0.1ml待测药品，0.1mL供试菌悬液，均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。(涂布30min后再倒置)另设置对照组，涂菌，以等量无菌水（溶解药品物质）代替药液。上述操作在超净工作台内进行。将做好的细菌平板在37℃恒温培养24h，统计菌落个数，按照下式计算抑菌率。%100对照菌落数处理菌落数对照菌落数抑菌率实验结果表示为：平均数±标准误差（Mean±SDE）。菌种活化：37℃培养；约24H挑取两环于50ml液体培养基上活化：先恒温150r/min震荡12h,再静置培养8-12h。达到稳定期后，4度保藏，备用。生理盐水：8.5gNaCl加入到1000ml蒸馏水中，121度高压蒸汽灭菌15-20min即可。