杀菌和抑菌试验操作规范

杀菌和抑菌试验操作规范一、总则适用范围：本方法适用于医疗、卫生、食品等行业的杀菌和抑菌试验。引用标准：消毒技术规范2002二、术语消毒disinfection杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的处理。灭菌sterilization杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。消毒剂disinfectant用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。灭菌剂sterilant可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。杀灭时间killingtime,KT用于生物指示物抗力鉴定时,指受试指示物样本，经杀菌因子作用不同时间后,培养后的全部样本均无菌生长的最短作用时间(min)杀灭率killingrate,KR在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值，以其表达杀灭效果。灭对数值killinglogvalue微生物数量以对数表示时，消毒后与消毒前比较,以其减少的对数值来表达杀灭效果。三、菌悬液与菌片的制备(一)试验前应选择合适的细菌，在下述规定中表中‘+’为必做试验的微生物，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。(二)试验器械A.无菌蒸馏水B.细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和营养肉汤培养基等C.刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。D.数字可调移液器（10μl~200μl）及配套用一次性塑料吸头。E.浊度计F.游标卡尺(三)细菌繁殖体悬液的制备1取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0ml～10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。2取菌种第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用5.0ml吸管吸取3.0ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀。3初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。四、菌片的制备程序1滴染法染菌时，先用浊度计测定的菌悬液浓度，调至含菌量为1～5×108cfu/ml将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，菌液滴加量每片为10μl。用10μl移液器接灭菌塑料吸头，滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置37℃温箱内烤干（约20min～30min），或置室温下自然阴干后再使用。2每个菌片的染菌量，即回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为5×105cfu/片～5×106cfu/片。3配制菌悬液和制备菌片时，保持环境的洁净和安静，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。五、活菌培养计数技术1取含5.0ml稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用手掌上用力振敲80次，形成菌悬液。2将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入4.5ml稀释液。各组由左向右，逐管标上10-1、10-2、10-3......等。3将菌悬液样本在手掌上用力振敲80次，吸取0.5ml加至10-1管内。4将10-1管依前法在手掌上用力振敲80次，混匀，再吸取出0.5ml加入10-2管内。如此类推，直至最后一管。5选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为30cfu～300cfu者为宜），吸取混合均匀的悬液1.0ml加于无菌平皿内。每一稀释度接种3个平皿。需接种2个～3个不同稀释度。6将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15ml～20ml。置37℃温箱内培养7）每日观察细菌生长情况。培养至规定时间（细菌繁殖体为48h，白色念珠菌与细菌芽孢为72h），计数最终结果的菌落数。六、杀菌试验1首先按产品说明书要求配制消毒液。一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍，置20℃±1℃水浴备用。取已配制浓度为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml,(实际作用时菌浓度为107cfu/ml）。在无菌大试管，先加入0.5ml有机干扰物质，再加入0.5ml试验用菌悬液，混匀，置20℃±1℃水浴中5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液4.0ml注入其中，迅速混匀并立即记时。2待菌药相互作用至各预定时间，分别吸取0.5ml菌药混合液加于4.5ml经灭菌的中和剂中，混匀。3各管菌药混合液经加中和剂作用10min后，分别吸取1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。4同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。5所有试验样本均在37℃温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h观察最终结果；对细菌芽孢需培养72h观察最终结果。6试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值：杀灭对数值(KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）-试验组活菌浓度对数值（Nx）1)在悬液定量杀灭试验中,各次试验阴性对照无菌生长，阳性对照回收菌数在1×107cfu/ml～5×107cfu/ml范围内，各次试验的杀灭对数值均≥5，为消毒合格。2)在载体定量杀灭试验中，各次试验阴性对照无菌生长，阳性对照回收菌数在5×105cfu/片～5×106cfu/片范围内，各次试验的杀灭对数值均≥3，为消毒合格。3)空气消毒实验室试验和模拟现场试验，各次试验阴性对照无菌生长，阳性对照菌数均在5×104cfu/m3～5×105cfu/m3范围内，各次试验的杀灭率≥99.90%，现场试验各次自然菌消亡率≥90.00%,为消毒合格。七、抑菌试验1)抑菌片的制备：取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加抑菌剂溶液20μl，后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃)中烤干，或置室温下自然干燥后备用。溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为5mm，厚不超过4mm圆片(块)，每4片(块)一组。2)阴性样片的制备：取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水20μl，干燥后备用。溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本，取同种材质不含抑菌成份的相同大小的样品。3)试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为5～5×106cfu/ml试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。4)抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱，培养16h～18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录。试验重复3次。5)测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。6)评价规定抑菌作用的判断：抑菌环直径大于7mm者,判为有抑菌作用。抑菌环直径小于或等于7mm者,判为无抑菌作用。3次重复试验均有抑菌作用结果者,判为合格。阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。