微生物检验操作规程

页眉内容微生物检验操作规程1.目的建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作规范化。2.范围适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。3.职责3.1微生物检验员负责微生物检验的全过程；3.2QC主管负责监督检查本规程的有效实施。4.操作规程4.1微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤4.1.1一般的玻璃器皿（例如培养皿、试管、三角瓶等），可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢，然后用自来水、蒸馏水充分冲洗，直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜，即器壁既不挂水珠也无条纹，即洗涤达到标准。4.1.2玻璃器皿内有污迹不能洗净时，可浸泡于洗液中，待器皿中有机物氧化分解后，取出用自来水、蒸馏水冲洗干净，备用。4.1.3新购的玻璃器皿先用2％盐酸浸泡，再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。4.2器皿的包扎4.2.1试管：塞上胶塞，然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。做发酵试验时，将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。4.2.2三角瓶、抽滤瓶：将三角瓶（抽滤瓶）口塞上胶塞，然后用牛皮纸把塞头部包起来。4.2.3吸管：将耐高温的移液枪头装盒，用用牛皮纸或报纸包裹。4.2.4平皿：10个为一组，用牛皮纸包裹。4.3消毒和灭菌：4.3.1化学灭菌：此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。如人手等。（1）用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。（2）一般用1～2%的甲醛液浸泡软管和用具。（3）一般成品漂白粉的有效成分是25～32%。使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内，（对金属有腐蚀作用）放置10～15min后冲洗即可。（4）氯灭菌剂的能力以有效氯表示，将氯水配制成50～100PPm的有效氯溶液，可用于浸泡，冲洗和表面杀菌。但氯对金属有腐蚀作用。4.3.2物理灭菌：固体试液、液状石蜡等。灭菌条件一般选用在160℃干热空气灭菌2h。（1）器具用牛皮纸或灭菌袋包（装）扎，放入金属容器内。（2）器具在干燥箱加热前放入，每个器具之间留有足够的空隙，使热空气能畅通。（3）关闭箱门接通电源，打开通气孔，使箱内湿空气能逸出，至箱内温度达到100℃时关闭。页眉内容（4）加热至160℃，保持2小时。（5）切断电源，冷却至60℃时，打开箱门，取出灭菌器具，并打开箱顶通气口。注：灭菌时必须注意温度不能超过180℃，以免使棉花、报纸烘焦；灭菌时不得打开箱门；干燥箱未冷却时，不要取出里面器具，防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸璃器具爆炸。无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损伤的物品。详见《压力蒸汽灭菌器操作规程》。（1）装入培养基的瓶用胶塞盖上，再用牛皮纸包扎。（2）瓶中的培养液不要超过1L，否则灭菌不彻底。（3）容器的上部应留有足够的空间（一般不超过装量的2/3），以便产生气泡。（4）器具用牛皮纸包裹。（5）器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。（6）各类器具装入灭菌器时，相互间要留有空隙以使蒸汽自由流动。4.4无菌操作的准备工作及注意事项4.4.1微生物室应定期按《微生物实验室管理规程》清洁。4.4.2微生物室使用前，应先打开紫外灯灭菌20～30min。4.4.3微生物室应备有专用剪刀、镊子、接种针，每次使用前后应灭菌消毒。4.4.4微生物室应备有75%酒精棉球；新洁尔灭消毒液内浸纱布数块，备用。4.4.5进入微生物，换专用鞋，穿好洁净服，离室时脱去洁净服和专用鞋，洁净服和专用鞋只准在微生物室内使用，不准穿到其它地方去，并定期洗换和消毒灭菌。4.4.6样品检验前应在原始记录本上记录名称、批号等内容，并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期等内容。4.4.7无菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。4.4.8操作要正确迅速，所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。4.4.9检验完毕，立即清理工作台，弃去不需要物品，打开紫外灯灭菌20～30min。4.5微生物检验用培养基、溶液的配制、使用与储存配制方法参见培养基说明书或检验标准项下规定配制。4.5.1水：电导率在25℃时不超过25μs/cm，除非另有规定要求。4.5.2称重和溶解：保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定，已制备好的培养基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30min，使其与室温一致再使用，因为气体的溶解度可因温度上升而降低，特别是乳糖胆盐发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡，这一点必须注意。4.5.3pH的测定和调整：用pH计测pH，必要时在灭菌前进行调整，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，pH应在标准pH±0.2范围内。一般使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调整培养基的pH。4.5.4分装：将配好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积应比培养基体积最少大20%。4.5.6培养基的使用：页眉内容经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间，融化后避免过度加热。融化后应短暂置于室温中（如2min）以避免玻璃瓶破碎。融化后的培养基放入47℃～50℃的恒温水浴锅中冷却保温，且应尽快使用，放置时间一般不应超过4h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意，融化后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参考指定的标准。倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为3mm（直径90mm的平皿，通常要加入18mL～20mL琼脂培养基）。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板需储存，或者培养时间超过48h或培养温度高于40℃，则需要倾注更多的培养基。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）5℃±3℃冰箱的密封袋中，以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记，标记的内容包括名称、制备日期和（或）有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对培养基表面进行干燥处理。对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱或培养箱中（温度设为25℃～50℃）；或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。4.6检验方法做样前，将灭菌好的吸管、培养皿等放入操作台上，操作台、微生物室紫外线灭菌30min，然后关紫外线灭菌灯，开启净风循环30min后开始做样。详见附录各检测方法附录1菌落总数测定附录2霉菌和酵母计数附录3大肠菌群计数附录4大肠埃希氏菌计数附录5沙门氏菌检验附录6金黄色葡萄球菌检验附录1菌落总数的测定方法1.样品的稀释1.1固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水中均质1min～2min制成1:10的样品匀液。1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3用1mL微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。页眉内容1.6及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。2.培养2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按条件进行培养。2.3菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。2.3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。2.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。2.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。3结果与报告3.1菌落总数的计算方法3.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。3.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：式中：N——样品中菌落数；ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。3.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。3.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。3.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.2菌落总数的报告3.2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。3.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。页眉内容3.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。3.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。3.2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。页眉内容附录2霉菌和酵母菌计数1.样品的稀释1.1固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即1:10稀释液。1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3取1mL1:10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，此液为1:100稀释液。1.4按1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。1.6及时将15mL～20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。2.培养待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。3.菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（CFU）表示。选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。4.结果与报告4.1计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。4.1.2若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不